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3_ (4-7)reg (Avete poco Rna (3_ Amplificazione dei frammenti (Aggiungendo…

- - - - In genere per le RT la temperatura è 60 C°, (scelta tra intervallo di 40-60°C)
      - E' influenzata dalla lunghezza e dalla sequenza (G-C)
        
        1_ La lunghezza della sequenza circa 200-500 coppie di basi (+corta non viene rilavata in gel, + lunga inefficiente)
        
        2_ Un GC che è del 30 fino 80% [ GC legame forte 3ponti H, risp AT]
    - - Quindi nel DNA genomico
        
        Il primer appare spezzato in due parti,
        
        Una parte su un esone e l’altra sull’altro esone
        
        In caso di contaminazione da DNA genomico non occorre trattare il RNA con delle DNAsi
        
        I primer se disegnati bene NON amplificano il DNA genomico.
      - Disegno dei primer
        
        Devono avere la regione 3’ non molto verso la giunzione, ma spostata dall’altra parte
        
        Il DNA genomico non viene amplificato perché
        
        Quando il primer si ibrida sul DNA genomico, questo non ha il 3’ appaiato e la polimerasi non ha un innesco
    - - Scelta di 2 sequenze ad entrambi i lati della regione
  - - - Regioni che si desidera amplificare
    - - Questi possono ripiegarsi al loro interno, possono ibridarsi tra di loro e tra la stessa specie di primer.
  - - - Le forcine sono strutture intramolecolari
      - Utilizzo di programmi bioinformatici che danno la Tm, oppure il deltaG
      - Ibridi possono essere intra e inter
    - - BLAST stem
      - E' un Programma che, sulla base del genoma dell'organismo che state analizzando, dice quanti ampliconi diversi dal vostro atteso possono essere generati con la coppia di primer disegnato
      - In- Silico PCR
  - - - Voi dovete andare ad analizzare mRNA o RNA la differenza
        
        E' il fatto che l’mRNA ha subito splicing e quindi non ha più gli intorni
      - Contaminazione
        
        Tale disegno permette di discriminare se il nostro RNA è contaminato da DNA genomico
        
        Ottengo 2 Ampliconi di lunghezza diversa
      - Come ??
        
        2_ Temperatura di melting,
        
        Posso avere 2 temperature
        
        A_ Contaminazione
        
        Un amplicone grande avrà un’alta temperatura di melting, mentre l’amplicone piccolo (derivante dal cDNA) bassa
        
        B_ Ibridi di Primer
        
        Avrò una temperature più basse di quella del mio amplicone piccolo derivante dal cDNA
        
        3_ I primer se si appaiano lo devono fare per almeno il 50%
        
        I Dimeri di primer daranno un Tm più bassa
        
        Quindi daranno origine ad ampliconi di 20 bp, (rispetto all'amplicone dove abbiamo disegnato i primer 60pb)
        
        1_Avremo 2 ampliconi di lunghezza diversa
  - - - Confattore essenziale per la Taq polimerasi (1,5mM)
      - Concentrazione > aumenta la resa di reazione ma ne < l'aspecificità (il contrario > specifi ma < attività enzimatica)
- - - - Due polimerasiche una su stampo a Rna e una su stampo a Dna
      - però l’attività di taglio sul mRNA quando questo è ibridato al DNA è stata ridotta.
  - - - Ciò fa si che sia disponibile TUTTA l’Energia per la sintesi del cDNA
      - = Ottenendo un retro-trascritto molto più lungo
    - - QUINDI
        
        Abbiamo una parte di Retrotrascrizione con lunghezza variabile
      - Conseguenze
        
        Nel disegno dei primer
      - Quindi se usiamo un
        
        Oligo dt
        
        Quindi NON avremo l’amplicone desiderato.
        
        Non riesce a Retrotrascrive oltre 1500-2000pb
        
        Quindi in genere si disegnano
        
        Nella regione 3’UTR del trascritto e non nelle regioni 5’ del trascritto
        
        Questo è dovuto alla processività della retrotrascrittasi
        
        Se volete avere un retrotrascritto full end
        
        Dovete usare dei Random primer
    - - A cosa SERVE ?
        
        Nella costruzione di librerie full lenght si utilizza un metodo = “smart”.
      - Cosa consiste ?
        
        Abbiamo la possibilità di Aggiungere un Primer che si lega alla regione 5’ del mRNA
      - Come avviene ?
        
        Mentre si Retrotrascrive, se utilizzate Super Script
        
        Questa arriva fino alla fine del vostro Messaggero Aggiunge dei nucleotidi in genere delle G
        
        Alla fine nel Retroscritto avremo
        
        La presenza di 3-4 C alle quali vanno ad ibridarci un oligo.
        
        Questo permette di avere un ancora in 5’ per fare una PCR con l’ Oligo-dt**
        
        di modo da Amplificare a dismisura il full-lenght del nostro RNA
  - - - Sintesi sia su stampo a Dna e su stampo a Rna.
      - Taglia l’Rna a partire da ibridi di DNA mRna
        
        E' quella che a noi piace poco perché
        
        Quando abbiamo il nostro Retro trascritto è possibile
        
        che vada a Tagliare da qualche parte il vostro Rna messaggero
        
        E l’Ibrido DNA mRNA è un abbastanza stabile che vi permette di mantenere in soluzione il vostro retro trascritto per un tempo indefinito.
- - - - Vantaggi
        
        in termine di spesa
        
        discriminare mediante curva di dissociazione
        
        e quindi disegno dei primer su 2 esoni diversi
      - Es_SYBR Green
        
        Emissione della fluo solo quando è intercalato al dsDNA (quando gli ampliconi sono appaiati )
        
        CARATTERISTICHE
        
        Positivi
        
        Economico /Metodo ad Elevata sensibilità
        
        Semplice da utilizzare ( è un componente da aggiungere alla PCR, non è da progettare)
        
        E indipendente dalla sequenza quindi è adattabile a tutti i protocolli di PCR
        
        Negativi
        
        Aspecifico
        
        Si intercala a
        
        Ad ampliconi aspecifici da primer disegnati in modo errato
        
        1 more item...
        
        Non POSSO distinguere la fluo da ampliconi diversi
        
        E' possibile però programmando il Termociclatore
        
        in modo tale da generare una curva di Metling del prodotto al termine dell'amplificazione
        
        1 more item...
        
        Non permette il Multiplexing
        
        Non discrimina la presenza di 2 ampliconi diversi se ho nello stesso pozzetto 2 coppie di primer (che identificano 2 geni diversi)
        
        Se volete paragonare l'espressione di più geni diversi devono disegnare degli ampliconi delle stesse dimensioni ( 60pb) altrimenti si intercalano in modo diverso
      - Si basa su degli Agenti Intercalanti
        
        Sono fluorescenti quando si intercalano alla doppia elica di Dna che viene neosintetizzata
      - Svantaggi Non discrimina
        
        tra dimeri di primer
        
        ampliconi che non sono specifici
    - - Le sonde Sono fluorescenti quando si ibridano alla doppia elica di DNA che viene sintetizzata
      - Possono essere
        
        Lineari
        
        Caratteristiche generali
        
        + Economiche, rispetto al SYBR Green
        
        Es_ Le sonde TaqMan
        
        Si basano sulla FRET (fluorescence resonance energy transfer)
        
        Fluoroforo > utilizato
        
        Principalmente sono utilizzati il 6-FAM (fluoroforo) e TAMRA (quencer)
        
        Devono essere compatibili con i filtri dello strumento
        
        Hybridization Probe
      - Queste vanno ad identificare un gene particolare, si basano sulla fluorescenza di una sequenza ben specifica
      - Le sonde sono caratterizzate da:
        
        Un gruppo fluorescente
        
        Da un gruppo quencher;
      - Metodo Basato sulla FRET
        
        Avviene solo quando il fluoroforo reporter e quencher si trovano molto distanti tra loro
        
        Metodo che si basa sulle proprietà di trasferimento di energia di risonanza tramite fluorescenza
        
        Se il reporter e il quencer non sono co-localizzati
        
        La stimolazione del reporter causa rilevazione di luce alla frequenza di emissione del reporter stesso
  - - - 3_ Estensione 72°C 30 sec
        
        Lettura
        
        Quanto agente intercalante (quindi quanta fluorescenza viene introdotta) in base alla quantità di amplicone che ho prodotto.
        
        La fluo viene letta al termine della fase di extension, dipende dal tipo di sonda(SYBR green / per tutti e 40 cicli)
        
        La detection del gene è basata su un disegno di primer altamente specifico. (stessa lunghezza)
        
        I primer oligonucleotidici vengono estesi dalla DNA polimerasi che incorpora i singoli DeossiRiboNucleotidiTrifosfati (dNTPs) complementari al DNA stampo
        
        2_ Annealing a 60C° dura meno di 1min
        
        La temperatura di annealing del primer (𝑇𝑎) è condizionata dal loro contenuto di basi (G) e (C) e dalla loro lunghezza
        
        𝑇𝑚 = 4 𝐺 + 𝐶 + 2 𝐴 + 𝑇 °𝐶
        
        Dove G,C,A e T indicano il numero di nucleotidi contenenti le basi azotate
        
        Nel caso che i due primer abbiano delle 𝑇𝑚 differenti, si utilizza in genere la 𝑇𝑚 più bassa
        
        I primer si appaia al cDNA e l'agente intercalante si intercala nella regione di appaiamento
        
        La macchina porta tutto a 95°C quindi dissocia tutto e dopo pian piano riassocia fino ai 60°C (perché fino ai 60°C perché al di sotto i primer non si sarebbero riassociati), e poi si dissocia tutto a 95°per tornare nella condizione iniziale
        
        La temperatura di Annealing viene stimata, sulla base di quella di Melting, secondo la seguente reazione
        
        𝑇𝑎 = 𝑇𝑚 − 5 °C
        
        Ultimi Cicli di amplificazione la Reazione Rallenta,
        
        A causa del consumo di reagenti e della riduzione di attività della polimerasi,
        
        Fino al raggiungimento di un plateau
        
        Nel quale non si ha più amplificazione a causa dell’esaurimento dei reagenti e dell’accumulo di prodotto.
      - 1_ Denaturazione Attivazione della Taq polimerasi
        
        E' da attivare, hanno un anticorpo in modo tale da permettere di lavorare sul bancone senza l’utilizzo del ghiaccio
        
        Si fanno 10-15' a 95° denaturando in questo modo l’anticorpo.
        
        Dove i primer non sono anilati, / dove l' intercalante sta in soluzione
      - Vengono ripetute 40 volte
  - - - non ho modo di capire se i primer disegnati funzionano oppure no.
    - - Dice a che temperatura si dissociano i vostri ampliconi (cn Syber)
      - E' la derivata negativa prima dell’intensità di fluorescenza sulla temperatura della curva di melting.
    - - Tm
        
        la T° alla quale il filamento si trova per metà ssDNA(singolo silamento ) e per metà dsDNA
    - - 1_ Controlli negativi
        
        Che sono la vostra mix di reazione senza il DNA (il templato)
        
        Permette di verificare
        
        Eventuale contaminazione dei reagenti daranno prodotti di amplificato
        
        Invece Non mettendo lo stampo porta ad un profilo flet (tra 3 e 13-15ciclo) che corrisponde al rumore di fondo.(quant'è la fluo per determinare il Rumore di fondo)
      - 2_ Controlli positivi
        
        Si intende un DNA stampo che sappiamo che funziona con la coppia di primer che stiamo utilizzando per fare l’amplificazione.
        
        Sono utili se non abbiamo reazione di amplificazione
    - - Dopo un certo numero di cicli la fluorescenza >
      - Numero di cicli necessari per la formazione di un prodotto
      - E' inversamente correlato alla quantità iniziale di stampo
- - - - E' una Dna-Polimerasi Rna-dipendente (utilizza lo stampo di RNA per formare Dna )
      - Derivano dai retro-virus,
      - Per funzionare necessita di un innesco =
        
        1_ un olido dt
        
        si lega alla coda PoliA del mRNA
        
        per Funzionare necessitano
        
        della CodaPoliA
        
        se non è presente la coda non funzionano
        
        alcuni trascritti per gli istoni o rRNA, i tRNA ,microRNA = non sono retrotrascritti
        
        RNA devono avere forma lineare
        
        Caratteristiche
        
        in posizione 3’ ha Due nucleotidi casuali
        
        Come funziona
        
        Retro-trascrivere la parte 3’ UTR a partire dal suo terminale
        
        Facendo si che
        
        NON si perda attività Polimerasica trascrivendo delle A che non hanno grossa informazione per il trascritto
        
        2_ Random Primer
        
        nel caso non ho la coda PoliA
        
        Permette di retrotrascrivere Tutto l’RNA
        
        Uso dei primer di lungh.6-7-8-9 nt
        
        Hanno sequenza N, significa che in ciascuna posizione si può inserire una delle 4 basi
        
        e quindi sarà un mix casuale di primer a sequenza casuale che si potranno ibridare in posizione casuali lungo la sequenza del RNA
        
        3_ Mix dei due
        
        da il vantaggio di avere un retrotrascritto
    - - Può essere
        
        Ancorato o Meno
        
        Caratteristica
        
        Oltre ad avere un Oligo-dt
        
        in posizione 3’ ha Due nucleotidi casuali
        
        Di modo tale che
        
        L'oligo-dT si leghi alla posizione terminale del poliA
        
        Quindi
        
        Oligo dt o un Random Primer
        
        Nel 90% dei casi si utilizza un Oligo-dt di lunghezza 18-20 t.
        
        Differenza sta nella retrotrascrizione
        
        Oligo dt
        
        Retrotrascriviamo solo un Rna con il poli-A
        
        Se vogliamo fare una PCR con ampliconi lunghi
        
        Primer
        
        1_ Random Primer
        
        Retrotrascriviamo
        
        Può Retrotrascrivere un trascritto molto lungo,
        
        1 more item...
        
        2_Specifici
        
        Retro trascrivere SOLO un determinato Rna derivante da un particolare gene
        
        Danno un elevata selettività di che cosa viene retro trascritto
        
        Se vogliamo fare una PCR con ampliconi lunghi
        
        Quindi l’utilizzo di determinati Primer sta nella domanda biologica.
  - - - Produce un retroscritto che non corrisponde alla lunghezza intera del nostro RNA
    - - A_ Saltare completamente quella conformazione
      - B_ Bloccarsi a livello di quella conformazione
    - - 1_ Scaldare il campione a 65-70C°,
        
        Ciò permette di districare le associazioni intra-molecolari di RNA,
      - 2_ l’RNA viene poi messo in ghiaccio in modo da impedire che si riformino tali strutture
      - 3_ Inizio della retro-trascrizione con l’RNA denaturato.