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NORDEN (ALLA FINE (l'ATP si attacca (Quindi avremo un sacco di rumore…

- - - - Ibridiamo anche la soluzione
  - - - Abbiamo delle biglie con dei pori che permettono il passaggio dei nucleotidi ma non delle molecole del DNA(solo per ingombro sferico)
        
        la mol grande passerà negli interstizi generati dall'impaccamento dele biglie
      - 1° uscirà il DNA marcato radioattivo in gamma
- - - - perchè essendo incorporato il nt è il gruppo P radioattivo in alfa che permette di fare il ponte fosfodiesterico
        
        perchè abbimo estremità 3'OH il ponte fosfodiesterico viene permesso dal gruppo P del nt che viene incorporato
      - quindi il gruppo P radioattivo deve essere presente in a
  - - - e se nella soluzione ci sono dele adenine, delle citosine aggiungono senza necessità di stampo delle code di adenine, citosine a secodna di cosa c'è nella soluzione
    - - vedeono un elica di dna o Rna in genere di rna con un estremità 3'OH
  - - - e questo fa si che questo rna HA UNA CODA SI pOLI a
    - - QUINDI viene usato al posto dell'ATP la CORDICEPINA che ha un 3' H (simile a quello usato nel sequenziamento )
- - - - 3_ Immobilizzazione su un filtro nitrocellulosa
        
        si mette in una busta dove viene aggiunta di una soluzione per permettere ibridazione della sonda con il DNA
        
        ho una sonda carica negativa , RNA è carico negativamente ....xche non si respingono ?
        
        perchè ci sono dei sali nella soluzione di ibridazione
        
        vengono utilizzati delle soluzioni con sali a carica positiva in modo tale che si ibridino agli acidi nucleici e schermino la carica negativa
        
        le forze di wander wall tra appaiamenti di basi complementari della carica di repulsione dovuta alla medesima carica tra RNA e la sodna
      - 1_ Estrazione del RNA
      - perchè si denatura ?
        
        per renderlo lineare
        
        Altrimenti gli RNA si ripiega su se stesso
      - 2_ Denatura riscaldandolo a 65°C x 2-5min
        
        si raffredda in ghiaccio e si mette nei pozzetti e corsa
      - 4_ un oligo nt (che è la sonda) viene marcato con un gruppo fosfato radioattivo
      - 5_ lavo la membrana e faccio autoradiografia e vedo lo spot dove la sonda si è ibridata
    - - 1_ Identificare la presenza di
        
        Determinato RNA in un specifico tess
        
        Differenti trascritti di uno specifico gene (Isoforme)
        
        Posto ad altezze diverse
        
        Questo è dato dal super avvolgimento
        
        Dipende dalla stabilità termica /moti browniani.
        
        oppure RNA degradato
        
        quindi sonda specifica riconosce l Rna da analizzare ma per qualche motivo non è venuta l' estrazione
        
        quindi vediamo dimensioni diverse del nostro RNA
      - Assumendo che mRNA totale sia caricato alla stesse quantità stato denaturato (95C)
      - 2_Stimare la Quantità relativa di quel mRNA
        
        Ottenendo una stima quantitativa relativa dell'intensità della banda
        
        nel tessuto 1 iso più abondnate è quella più corta quella più lunga è l iso meno abbondante visto che ha una banda più ridotta in termini di dimensioni
      - 3_ E' un mezzo che permette di identificare SPL alternativo
        
        il progetto genoma umano ha fornito la prova che il N° di geni è considerevolmente più piccolo rispetto al N° di prodotti genici
      - 4_ se la denaturazione non è venuta correttamente
        
        avrò corse diverse
  - - - COSA serve?
        
        1_ Per permettere che i tempi di corsa dei campioni siano tutti uguali
        
        Evitando la presenza di isoforme diverse
      - Dato che i campioni hanno un determinato super avvolgimento che dipende dalla stabilità termica
    - - Se la sonda ha il target specifico in un sito super avvolto, questa non lo riconoscerà.
    - - (almeno 1mg mRNA arricchito poli-A o 10mg RNAtot)
      - Richiede grandi quantità di materiale di partenza
- - - - Deriva da un batteriofago ( polinucleotilchinasi)
      - questa può trasferire un gruppo fosfato in a, b, gamma
    - - ATP marcato in alpha + kinasi
        
        NON abbiamo un OLIGO marcato
        
        Perchè quella chinasi trasferisce solo il fosfato presente in gamma, quindi ADP deve essere marcato in gamma
  - - - Se abbiamo come estremità 5’-OH
        
        abbiamo solo bisogno di ATP marcato radioattivamnete
    - - Se abbino l'estremità 5’ fosfato.
        
        dobbiamo eliminare il P in 5' si utilizza sempre la Poli nucleotil chinasi solo che nella mix di reazione si aggiunge ADP
        
        in modo tale che quel gruppo P vada a finire sull ADP e dopo l'ATP radioattivo caldo trasferisca il suo gruppo P in gamma tramite sempre la polint chinasi
      - Più in particolare
        
        Una quantità di ADP su cui viene trasferito il gruppo fosfato
        
        e quindi si forma ATP
        
        e ATP marcato in gamma,
        
        trasferisca il gruppo P all' estremità 5'OH neo generata
        
        Quando le quantità di ATP marcato radioattivamente e non-radioattivamente sono all’ equilibro,
        
        Avremo un certo numero di molecole marcate radioattivamente e un certo
        
        Gruppo di molecole che continuano a trasferire fosfati in gamma non radioativi.
- - - - COme la Western e la Souter consiste in una corsa
    - - sono piattaforma su superficie solida dove si depositano migliaia di sonde che permettono di analizzare tutto il trascrittoma di qualsiasi organismo