2.2 Lääkeaineen pitoisuuden määrittäminen näytteessä UV-Vis -spektrofotometrisesti
Koeasetelma
click to edit
- Alku- ja loppukonsentraationäytteiden valmistus
- Kalibraationäytteiden tekeminen:
-> kantaliuoksen valmistus: liuotetaan 0,045 g natriumbentsoaattia 50 ml fosfaattipuskuria* -> välilaimennos 1/5 10 ml mittapulloon
-> standardiliuosten valmistus taulukkoon laskettujen arvojen mukaisesti (Lambert-Beerin laki, absorbanssialue 0,2-0,8 ja molaarinen absorptiviteettikerroin (7900 l/mol×cm))
- Absorbanssimittaus näytteille Uv-Vis spektrofotometrillä aallonpituudella 229 nm
- Kalibraatiosuoran laatiminen absorbanssimittausten pohjalta (x-akselilla pitoisuus mol/l, y-akselilla absorbanssi) -> suoran yhtälö -> ratkaistaan näytteiden pitoisuudet sijoittamalla niiden absorbanssit yhtälöön
Menetelmän perusteet
click to edit
- Uv-Vis perustuu molekyylin kykyyn absorboida sähkömagneettisen spektrin ultravioletti- ja/tai näkyvän aallonpituuden säteilyä -> kromoforit (aromaattiset renkaat, karbonyyliryhmät ja konjugoituneet kaksoissidokset) -> elektronit virittyvät korkeammalle energiatasolle -> valo absorboituu näytteeseen -> detektori mittaa valon intensiteetin jota verrataan valonlähteen intensiteettiin
- valonlähde -> prisma -> näyte -> detektori
- Standardinäytteiden pitoisuuden määrittäminen perustuu Lambert-Beerin lakiin A = ε·c·l
Merkitys lääkeanalytiikassa
- Lääkeaineiden, apuaineiden, hajoamistuotteiden tai metaboliittien pitoisuuden määrittäminen
Virhelähteet
click to edit
- Natriumbentsoaatin epätarkka punnitseminen tai jääminen punnitusalustaan
- Analyysivaa`an kalibraatio ei kunnossa
- Natriumbentsoaatti ei ole liuennut kunnolla kyllästettyyn fosfaattipuskuriin (esim. huolimaton sekoittaminen, liuotus 50 ml vaikka pitäisi ensin liuottaa pieneen määrään)
- Pipetointivirheet välilaimennosta tai standardiliuoksia tehtäessä
- Laskuvirheet: Kantaliuoksen tai välilaimennoksen pitoisuudet laskettu väärin, laskuissa käytetty epätarkkoja punnitustuloksia, arvot sijoitettu väärin Lambert-Beerin kaavaan, väärien absorbanssiarvojen tai absorptivitettikertoimen käyttö, yksikkömuunnosvirheet (esim. mol/l -> mg/ml), unohdetaan ottaa huomioon automaattipipettien askelvälit, jolloin ei saada standardiliuoksen todellista pitoisuutta, pyöristysvirheet, standardien välilaimennosmäärä laskettu väärin, arvojen merkitseminen väärin taulukkoon)
- Standardinäytteiden epähuolellinen sekoittaminen
- Standardinäytteet merkattu epähuolellisesti
- Väärän aallonpituuden käyttö absorbanssimittauksessa (pitää olla maksimiabsorbanssi -> mahdollisimman toistettavat ja herkät analyysit)
- Nollanäytteen aallonpituusmittaus unohdetaan -> näytekyvetistä ja näytematriisista heijastuneen säteilyn intensiteetti ei nollaudu
- Kyvettiä käsitellään huolimattomasti (sormenjäljet yms)
- Kyvetti asetetaan väärin päin spektrofotometriin
- Standardinäytteet mitataan väärässä järjestyksessä
- Kyvettiä ei huuhdella mittausten välissä seuraavaksi mitattavalla liuoksella
- Kyvettiä ei huuhdella fosfaattipuskurilla* ja seuraavaksi mitattavalla liuoksella väkevimmän standardinäytteen ja uuttonäytteiden välissä
- Absorbanssiarvot merkitään väärin muistiinpanoihin
- Arvojen syöttäminen väärin exceliin -> kalibraatiosuora vääristyy