Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
2.1 Lääkeaineen logP-arvon määrittäminen ravistelumenetelmällä…
2.1 Lääkeaineen logP-arvon määrittäminen ravistelumenetelmällä
Koeasetelma
Valmistetaan 200 ml 0,1 M kaliumdivetyfosfaattiliuosta A
Valmistetaan 500 ml 0,1 M dikaliumvetyfosfaattiliuosta B
Kalibroidaan pH-mittari standardipuskuriliuoksilla pH 7 ja pH 10
Valmistetaan fosfaattipuskuri: A 120-125 ml + B ad. kunnes pH 7,4
Kyllästetään uuttofaasit toisillaan: erotussuppiloon 600 ml puskuria + 90 ml oktanolia -> ravsitelu + erottuminen
Uuttonäytteen valmistaminen: Punnitaan tarkasti n. 30g natriumbentsoaattia ja liutotetaan se 25,0 ml:aan fosfaattipuskuria
-> Otetaan 1 ml näyte ja laimennetaan fosfaattipuskurilla
1/100 (alkukonsentraationäyte)
Uutto: fosfaattipuskuriin
jossa on natriumbentsoaatti liuotettuna, lisätään 25 ml oktanolia -> ravistellaan 1 tunti tasoravistelijassa -> kaadetaan erotussuppiloon ja annetaan erottua väh. 1h -> lasketaan faasit omiin dekantterilaseihin -> otetaan vesifaasista 1 ml näyte ja laimennetaan fosfaattipuskurilla
1/100 (loppukonsentraationäyte)
Kalibraationäytteiden tekeminen
Absorbanssimittausten tekeminen
Kalibraatiosuoran laatiminen -> näytteiden alku- ja loppukonsentraatiot suoran yhtälön avulla
Lasketaan näennäisen jakautumistilavuuden arvo D, josta saadaan logD, ja edelleen logP (lakussa tarvitaan hapon pKa:ta ja pH:ta)
Menetelmän perusteet
Neste-nesteuutto -> kaksifaasisysteemi: vesifaasi (haluttuun pH-arvoon säädetty puskuriliuos) ja orgaaninen faasi (n-oktanoli, vastaa rasvaliukoisilta ominaisuuksiltaan elimistön biologisia kalvoja)
Näyte jakaantuu faasien välille liukoisuusominaisuuksiinsa perustuen: tutkittava aine liuotetaan vesifaasiin ja lisätään orgaaninen faasi -> ravistelu -> jatketaan kunnes tutkittava aine on saavuttanut tasapainon kummankin faasin välillä ja jakautumista ei enää tapahdu -> faasien erottaminen toisistaan erotussuppilon avulla -> pitoisuuksien mittaaminen
Ionisoitumaton muoto jakaantuu orgaaniseen faasiin, ionisoitunut vesifaasiin
Tarkoituksena siis saada selville missä suhteessa tutkittava aine jakautuu kahteen toisiinsa sekoittumattoman faasin välillä
Merkitys lääketutkimuksessa
Lääkemolekyyliltä vaaditaan riittävän rasvaliukoista luonnetta, jotta se voi päästä elimistöön ja saada aikaan halutun terapeuttisen vaikutuksen -> täytyy läpäistä biologisia kalvoja + lääkeaineiden ja kohdemolekyylien väliset hydrofobiset vuorovaikutukset
Ravistelumenetelmän avulla voidaan mallintaa lääkeaineen jakautumista elimistössä
Vesifaasin pH:ta säätämällä voidaan tutkia spesifisesti (esim. ohutsuolen pH 6,5)
Virhelähteet
Punnitusvirheet kaliumdivety- ja dikaliumvetyfosfaattia punnittaessa -> liuosten väärä molaarisuus
Virheet kalibroinnissa -> elektrodin huono huuhtelu, väärä standardipuskuriliuos…
Elektrodin osuminen näyteastian reunaan tai asettuminen sekoittajan elektrodin päälle -> pH tulos vääristyy
Puskurikomponentteja lisätään liikaa/liian vähän fosfaattipuskuria valmistettaessa -> pH-tulos ei ole haluttu 7,4
Uuttofaasien erottumista toisistaan ei olla odotettu tarpeeksi kauaa
Nestepisaroiden jääminen erotussuppilon reunoille
Natriumbentsoaatin epätarkka punnitseminen: väärin punnittu, punnitustulos kirjattu väärin, analyysivaa`an kalibraatio ei kunnossa
Natriumbentsoaatin jääminen punnitusalustaan tai erlenmayerin reunoille
Natriumbentsoaatti ei ole liuennut kunnolla kyllästettyyn fosfaattipuskuriin (pidetty esim. liian vähän aikaa tasoravistelijassa)
Kyllästettyä fosfaattipuskuria pipetoitu väärä määrä uuttonäytteeseen
Uuttonäytteen laimennosvirheet: pipetoidaan eri määrä kuin 1 ml näytettä, laimennetaan väärään määrään fosfaattipuskuria tai väärä laimennussuhde, laimennosten epähuolellinen sekoitus, laimennospullot merkattu väärin
Uuttoliuoksen valmistuksessa lisätään väärä määrä oktanolia (esim. epätarkka pipetointi)
Uuttoliuos ei sekoitu kunnolla (liian lyhyt ravisteluaika)
Uuttoliuoksen liian kova ravistelu -> emulsion muodostuminen faasien rajapintaan -> osa näytteestä menetetään emulsioon
Faaseja laskettaessa erotussuppilosta, pääsee toista faasia toisen sekaan
Sekoitetaan kumpi faaseista on uutossa ylä- ja alapuolella tai merkitään dekantterilasit virheellisesti
Laimennosvirheet (kts. ylempänä)
Laimennoskerroin unohdetaan ottaa huomioon laskuissa
Laskuvirheet logD:tä ja logP:tä laskettaessa: unohdetaan ottaa huomioon vesifaasin ja orgaanisen faasin tilavuuksien ero (25 ml ja 24 ml), laskimen näppäilyvirheet, kaavoihin sijoittamisen virheet, väärän pH-arvon tai pKa -arvon käyttö