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Rnai (EDITING (Negli organelli delle piante è stato trovato un cambiamento…

- - - - Codificante
      - Ma anche regolativo (LongNNCRna e short ncRNA)
    - - Aumentano la diversità del trascritto alterando le sequenze nucleotidiche mediante
      - l'inserimento, la delezione o la conversione di un nucleotide.
  - - - questo necessita di tecniche di rilevamento e di analisi dei trascrittomi puntuali e sofisticate.
      - apolipoprot B nei mammiferi, che è un gene nucleari di dimensione elevate
      - editing avviene in un esone in cui la citosina in posizione 6666 del trascritto viene trasformata in U e questo produce uno stop , che porta allaproduzione di una proteina più corta, mentre questa va a localizzarsi nel tess intestinale dove media il trasporto dei lipidi, questa prot più corta la si ritrova nel fegato. entrambe circolano nel sangue a in tessuti diversi
  - - - Sono geni più corti di quello che sarà poi il trascritto codificante.
      - Non si possono riconoscere sulla sequenza del DNA perchè vengono modificati dopo la trascrizione
      - Modificano l' RNA per inserimento o delezione di alcune basi
    - - CONSISTE
        
        Questi Enzimi si chiamano APOBECs (fa parte di una famiglia di 10 diversi enzimi)
        
        Conversione di un Adenosina a Inosina per deamminazione
        
        Cambia una base da A a I
        
        Significa tradurre proteine diverse,
        
        Questo può influire sulla
        
        Splicing
        
        Può alterare la stabilità del RNA la sua localizzazione
        
        Traduzione
        
        Influire i microRNA
      - Li troviamo nelle regioni non codificanti del trascrittoma umano 3' UTR
      - Il livello di editing può cambiare da tess a tess
        
        può essere totale per un certo RNA
        
        o può interessare pochissime molecole percentualmente di un certo RNA
        
        e questo può influire sulla traduzione di una proteina/ varianti in diversi tessuti o diversi momenti dello sviluppo
      - E'un processo regolato dinamicamente, l'editing, non solo interessa cell diverse in momenti dello sviluppo o funzionale diversi ma ci può essere una certa variabilità anche in un certo pool di cell.
      - Metodi che hanno permesso di identificare questi siti
        
        con l'apparire di numerosi sistemi di sequenziamneto automatico, con lo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento del DNA e dell RNA sono stati riconosciuti un n° elevato di eventi di editing in organismi diversi
        
        Metodi usati = Sanger sequencing of ion channel receptors /Comparative genomics
        
        canali transmembrana per trasporto ioni il loro rRNA è soggetti a questo genere di modificazione, poi con l osservazione dei geni in cui questo fenomeno avveniva poi con analisi comaprativa dei genomi per sequenziamento sistematico delle regioni non tradotte al 3' dei messaggeri e poi una serie di tecniche specifiche per la localizzaizone delle variazioni che fanno uso di un clivag del DNA specifico a livello del residui di idrosina introdotto che fa uso del gliosale il quale fissa in vicinanza della base, trasformando le le G in borato
        
        abbiamo detto che le idrosine vengono lette come G dai sistemi di traduzione, ma se noi estraiamo RNA e utilizziamo il gliosale modifichiamo solo le vere G e non le I. per cui se siamo in grado di utilizzare dellel'RNAsi che a livello delle I si bloccano, per sequenziamento di un RNA non trattato e di uno trattato siamo in grado di individuare le posizioni precise delle I
        
        Sistemi high throughput per le EST
        
        Chemical mapping
        
        H a permesso di identificare i siti delle i
        
        Ci sono 2 metodi
        
        1_ Inosine specific cleavage of RNA
        
        fa uso di glioxale e del borato che in sequenza queste due moleocle modificano le G e le I in maniera diversa.
        
        Il borato è in grado di tagliare e produrre l'idrolisi a monte della guanosina modificata dal glioxale e taglia in corrispondenza dell'inosina ma non è capace per intervento della RNAsi T1 un endonucleasi a singolo filamento che taglia dal lato del 5' delle guanine e quindi libera dei frammenti di RNA che hanno 3' guanosina .
        
        ma se questa guanosina è stata precedentemente trattata con glioxanle e borato resiste al taglio ma questo non avviene in presenza dell'inosina
        
        in questo modo ci si può produrre dei frammenti tagliati specificamente a livelle delle I e col soito sistema dei praimar extension si estende il cDNA e si sequenzia (mediante campion etrattato e non trattato) che lì c'è un inosina
        
        2_ TECNICA CHIMICA uso dell Acrilonitrile che porta all Cianmetilaione dell'inosina
        
        che modifica in maniera specifica l'inosina
        
        se noi prendiamo i trascritti e facciamo il cDNA post retrotrascriione nel caso del witipe in cui è presente l'inosina viene introdotta una C al posto di questa e nel caso in cui l'inosina è stata modificata la retrotrascrizione si blocca in quel punto
        
        Successivemte i trascritti vengono sottoposti a a primer extention con successiva PCR e sequenziamento
        
        Nel 1 caso osserveremo 2 picchi pressoch coincidenti perchè a partire dallo stesso RNA avremo 2 pop diverse di trascritti a seconda che sia stato letto dalla Pcr il silamneto con l inosina o il filamento con l adenina e negli elettroferogrammi dal sequenziamento avremo 2 picchi sovrapposti A+G e nel caso dei trascritti cianoetilati avremo esclusivamente la A perchè negli altri trascritti la retro si è bloccata e la PCR non ha dato un amplificato
        
        Sistemi che consistono = Una volta identificat gli enzimi questo è uno degli enzimi ADAR che interviene nella modificazione da A a I, se conosciamo l enzima possiamo immunorecipitare l enzima legato all RNA e procedere con il sequenziamento e identificare la posizione dove agisce l enzima
        
        se osserviamo dove sono questi siti di modificazione la maggior parte delle modificazioni sono nelle regioni ALU
        
        regioni del genome identificate portano una sequenza GTAC riconosciuta da un enzima che taglia queste 4 basi
        
        dato che queste sono sequenze di 300 nt altamente ripetute. alla digestione del genoma con ALU faceva comparire dei bandoni (200-300nc)altamente ripetute in gel
        
        Ci sono però anceh ALU non ripetitivo
        
        e poi c'è anche un DNA non ripetitivo 2%
        
        troviamo diverse regioni funzionali del DNA la > sono regioni introniche, ci sono regioni intergeniche, regioni Non codificanti, c'è anche una buona porzione al 5' 3' dei trascritti non tradotte e in fine una quantità ridotta di sequenze codificanti (tradotte in proteine diverse)
        
        Regioni ALU
        
        sono regioni ripetute in tandem e invertite consentono la produzione di asole per appaiamento, di regioni di RNA a doppio filamento. l'Rna che viene trascritto da quelle regioni da luogo a regioni di appaiamento abbastanza lunghe di RNA. Quindi RNA a doppio filamento
        
        la presenza di RNA doppio filamento è necessario per il funzionamento dell enzima ADAR, esso riconosce RNA A DOPPIO filamento riconoscendo queste sequenze e delle regioni di appaiamento caratteristiche introduce la deamminazione in posizioni specifiche . e La reazione che viene catalizzata è una deamminazione idrolitica che non comporta la rottura del beck bone di RNA
        
        ADAR (adenosin deaminasi ) lavora sul RNA
        
        ci sono 3 diversi enzimi che possiamo ritrovare nell uomo e i primi due ADAR1 e DAR2 sono i più diffusi e sono localizzati nel nucleo mentre ADAR3 è una foma estesa
        
        riconosce l RNA a doppio filamento e riconsocendo anche delle regioni di appaiamento caratteristiche introduce la deamminazione in posizii specifiche
        
        ENZIMI ADAR sono presenti in diverse copie si consosce meglio è ADAR1 ci sono dei domini caratteristici, di legame al DNA a dopio filamento , di legame alla struttura Z del DNA . dominio dove c'è attività catalitica quella deamminasica . Adar1 è espresso in 2 isoforme quella più corta p110 è costitutiva ed espressa ubiquitariamente si trova nel nucleo, la forma più lunga è espressa a partire da un promotore inducibile dall interferone . si lega a regioni a doppio filamento organizzate in strutture a Z e ha un ruolo nel riparo del DNA danneggiatosi . contiene anche un peptide necessario all'export dal nucleo, quindi questa forma si può trovare sia nel nuucleo che nel citoplasma. ADAR2 (ruolo deamminazione della adenosina nell RNA ) e 3 identificati per omologia.
        
        Es_ la modificazione del gene per il recettore del glutammato e la conseguente sostituzione di una Glu con Arg una modifica che influenza la permeabilità al Ca2+.
        
        ( Un ruolo importante è solto su una serie di targhet che agiscono nel tessuto nervoso a seguito di modificazione di 3-4 aa del recettore della serotonina.)
        
        E un meccanismo importante nel modulare la plasticità proteomica e funzionale delle cellule nervose
        
        Es_ Rna codificanti per alcuni neurotrasmettitotri interessa alcuni fattori Nova1 (impor x mdulare spl alternativo , interviene nell attività di diversi piccoli RNA
        
        Es_ Si è potuto Osservare fin dagli anni 90', molti cavali trans membrana per il trasporto degli ioni o di piccole molecole, il loro RNA primario è soggetto a questo tipo di modificazione poi l osservazione dei geni in cui questo fenomeno avveniva
    - - EDITOSOMA
        
        Comprende
        
        Gli enzimi
        
        Necessari per inserzioni e delezioni
        
        RNA guida
        
        Che sono codificati dai mini circus ( nel tripanosoma)
        
        Sono molecole con sequenze complementari a regioni specifiche nel criptogene
        
        Funzionano anche se non c'è perfetta complementarietà
        
        INSERZIONALE
        
        Funzionano in questo modo
        
        1_ Trascrizione dell'RNA guida (è lui che porta l'apparato di modificazione al RNA primario)
        
        2_ APPAIAMENTO CON RNA primario intorno al sito dove avviene editing.
        
        AVVIENE in una regione che si chiama ancora(aggancia)
        
        Tollerano anche appaiamenti GU, quindi anche se non c'è perfetta complementarietà
        
        C'è anche una regione dette regioni di editing dove non avviene l'appaiamento.
        
        3_ Formazione di un LOOP nelle regioni dove non c'è appaiamento ( in genere sono dei piccoli loop di A)
        
        4_ Segnalano
        
        PRIMA ad una Endonucleasi
        
        che taglia l'RNA dove devono essere inserite le 2 UU , successivamente
        
        ARRIVA un enzima che si chiama Terminal Uridin-trasferasi
        
        perchè aggiunge le T al terminale 5' del trascritto primario che è stato tagliato
        
        5_ LIGASI
        
        Che chiude ripristinando un appaiamento completo
        
        Quindi vengono inserite le U in questo modo
        
        Sistema simile vengono delete quando
        
        l'ancora si ancora al trascritto primario
        
        e lascia libera un regione in cui sono presenti le U che restano fuori ,
        
        2 more items...
    - - Tripanosoma Brucei 80' nello studio del DNA mitocondriale di questo parassita
      - Ed. Conversione di basi Mitocondri e cloroplasdti organelli delle piante. Modificazoioni di basi inserite nel trascritto. La modificazione dell'adenosina, letta come G da tutti gli altri apparati di traduzione, di manipolazione
      - Ed. di C a U (mammiferi)
      - Inverso al precedente, ritrasformazione da U a C
      - Ed. che modifica le singole basi
    - - Il suo DNA mitocondriale è caratteristico composto da
        
        Qualche decina di DNA circolari
        
        Un DNA ripetuto in varie copie che contiene tutti i geni mitocondrile e da
        
        Minicircus di natura eterogenea
        
        Caratteristicamente portatori di un informazione,
        
        Sono piccole sequenze che vengono trascritte : RNAguida appartenente delll'apparato del editosoma che serve a modificare i geni presenti nel maxi circus
      - Consiste nell
        
        Inserimento di basi U nel RNA trascritto primario,
        
        in cui non si riconosce la sequenza della proteina
        
        Dopo la trascrizione dello strend non codificante l RNA che ne risulta .
        
        Non è ancora traducibile, lo diventa
        
        dal momento in cui saranno inserite un certo n° di U,
        
        successivamente sarà possibile tradurre le triplette e si otterrà la sequenza della proteina
      - SCOPERTO nei geni mitocondriali del parassita = Trypanosoma Brucei
  - - - a seconda di dove si verificano possono regolare, modulare lo splicing,la traduzione, l'export nucleare dal nucleo cioè un RNA può essere segregato nel nucleo e reso disponibile solo in un momento in cui la sua traduzione sia necessaria, .
    - - metilazioni delle basi già presenti nei trascritti
      - ci sono anche altri tipi di modificazioni di basi, ma le 3 più studiate sono le 3 che vi ho elencato. Adenosina è stata la 1 ad essere identificata negli anni 70' sono basi modificati e caratterizzare identificate in RNA isolati da piante drosofila ecc anche in RNA virali .
      - il contributo e la presenza non è irrilevante 0,1 0,4% dei residui di adenosina presenti nell RNA totale sono residui modificati dalla metilazione in posizione 6 e in questo caso sono stati anche identificati gli enzimi per la metilazione e demetilazione perchè sono legati ad alcune patologie (riguarda eccesso accumulo tess adiposo in mammiferi)
      - per questo enzima è stata anche identificata una sequenza consensus che viene riconosciuta RRACH , dove una base delle 2 R rappresentano 2 basi puriniche e l H indica che non deve essere una Guanina . Di fatto sono una A e una C la A è quella che viene modificata però devono avere questi tipi nt ad affiancare la A da modificare .
        
        la presenza di questo sito consensu non è detto che quella A sia modificata nel 100% dei casi, c' una variabilità nei diversi trascritti a seconda del tess cel del differenziamento , c'è una metilasi e una demetilasi
        
        è stata trovata anche negli introni
      - sono stati identificati una serie di enzimi: writer (metilano l adenosina in una seq consensus) eraiser ( quelli che la rimuovono ) e i riders <( riconoscono la modificazione, legano e mediano il segnale )
        
        nel Writing (METTLE 3-14 e WTAP) Erising (ALKBH5 e FTO) o Reading(ruolo nella degradazione/traduzione/maturazione di mRNA) di tali modificazioni.
      - per questo tipo di modificazione è stato dimostrato un ruolo importante sia nel differenziamento delle cel stem embrionali sia nella determinazione del ritmo circadiano
  - - - la trascrizione è importante affinchè un gene sia espresso ma questo non vuol dire che la traduzione avvenga, ci sono meccanismi di regolazione: dallo SPL , alla modificazione RNA, all interfirens, alla presenza dei Longnnc che possono mascherare, segregare e rendere indisponibile RNA all apparizione prima di arrivare alla proteina
- - - - Il Meccanismo di regolazione è basato
        
        Causano la Degradazione dell'mRNA o Blocco della traduzione
        
        Sul uso del RNA non codificanti che riconosce sequenze (parzialmente) complementari nel loro mRNA bersaglio
      - Sono piccoli RNA non codificanti altamente conservati
      - Che svolgono un ruolo importante nella regolazione post-trascrizionale
    - - Si legano alle sequenze tipiche:
        
        3'UTR dei loro mRNA bersaglio,
        
        o nella regione 5’-UTR.
        
        In questo caso, dà origine a un’attivazione della traduzione per isoforme proteiche generate da uno stesso trascritto per utilizzo di due codoni di inizio della traduzione
  - - - I geni codificanti per i miRNA sono trascritti nel nucleo dalla RNA-polimerasi II
      - Origina = pri-miRNA, struttura a forcina / presentano il cap e la poliadenilazione.
    - - dell'Esportina assieme ad una Ran-GTPasi.
    - - Il dominio PAZ di Dicer riconosce i due nucleotidi sporgenti,
      - Taglia per generare molecole
        di RNA duplex (20-22 nt e 2nt sporgenti) =miRna maturo
      - Dicer
        
        il sito di taglio è dato dalla lunghezza
        
        Proteina con più domini
        
        1_ Dominio helicase amminoterminale = che riconosce la struttura
        
        4_Dominio PAZ
        
        fissa le estremità / organizza i 2 domini sporgenti
        
        (dominio 110-130 aminoacido presente in proteine come Piwi, Argo e Zwille)
        
        2_ Motivo Double Rnase III nel segmento terminale carbossile ( i due domini, disposti simmetricamente attorno al ds-premiRNA, tagliano ciascuno dei due fili)
        
        Dominio dsRNA binding
    - - Interviene Drosha e Pasha
        
        Drosha (RNAsi di tipo 3) = Taglia il pri-miRNA in pre-miRNA
        
        Pasha definisce le regioni di taglio (ruler)
      - Genera degli RNA a doppia elica, lunghi 60 - 110 nucleotidi, (pre-miRNA.)con 2nt sporgenti al 3'
    - - e Reclutano ARGONAUTA
        
        Fa parte del complesso RISC (Assieme ad altre prot Ago1 /2/3/4)
        
        Argonauta Carica il miRna grazie chaperonine Hspc70 / Hspc90
        
        Il dominio WEDging _ scalza e rende instabile il doppio filamento( si inserisce nel doppio filamento) lo forza
        
        Successivamente si attiva il dominio RNAsico che taglia il filamento passeggero, resta attaccato soltanto RNA guida
      - n° 2 proteine (mammiferi se ne conoscono 2 TRBP e PACT) caricano l'RNA (il prodotto del taglio) con configurazione a doppio filamento
      - RISC o meglio miRISC
        
        con l'RNA guida si dirige su berasglio e si appaia
        
        Si verificano 2 condizioni relative all'appaiamento
        
        1_SE è Perfetto = RNA guida, si appaia e Argonauta taglia il messaggero = degrada
        
        2_ Se NON è perfetto e se NON c'è una doppia elica B destrosa =
        
        Argonauta si lega all'mRNA reprime la traduzione senza tagliare, in quanto impedisce la letra da parte del ribosoma
        
        =Repressione della traduzione
        
        Viene ad opera della proteine P-body
        
        mRNA si accumulano a tale livello e saranno eliminate o andranno verso la traduzione
  - - - E' perfetto nella regione seed,
      - Si trova al 5' dell'RNA (del miRna)
    - - si trova nella regione 3' UTR, regione molto variabile
- - - - e Stabilivano le FASI di sviluppo