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BIOTECNOLOGIE: tecniche e strumenti (I geni possono essere isolati a…
BIOTECNOLOGIE: tecniche e strumenti
Informazione genetica nel DNA è specifica per ogni individuo.
Il
Fenotipo
(caratt. manifestate dall'individuo) è specificato dal
Genotipo
(informazione genetica)
DNA Ricombinante
: ogni molecola di DNA in cui sia presente informazione genetica proveniente da due o più organismi differenti.
L'insieme delle tecnioche per ottenere e manipolare DNA riocombinante si chiama
Ingegneria genetica
.
Per generare un DNA ricombinante serve innanzitutto individuare le parti di DNA interessate all'unione.
DNA = Polimero formato da nucleotidi legati da un
legame Fosfodiesterico
tra un atomo di forsoforo e uno di ossigeno
Per rompere la catena di DNA:
enzimi di restrizione
(Idrolasi): gruppo di enzimi in grado di idrolizzare il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti .
essi tagliano le eliche del DNA e effettuano il taglio in corrispondenza di specifiche sequenze bersaglio.
Enzima più usato:
EcoRI
si lega alla sequenza palindromica. Le estremità dei due filamenti risultano quindi complementari, genera delle
estremità coesive
.
Altri enzimi:
EcoRV
effettua il taglio nel mezzo della sequenza di riconoscimento, genera delle
estremità piatte
.
Una volta tagliato il frammento di DNA, l'enzima
DNA Ligasi
ricostruisce il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti utilizzando ATP come cofattore.
Vettori plasmidici
:
molecole di DNA circolare a doppia elica usati per spostare i geni da un organismo a un altro
presentano tutti:
Un'origine di replicazione
:
potersi riprodurre nella cellula ospite
geni per la resistenza ad antibiotici
:
per selezionare le cellule con il vettore
sito multiplo di clonaggio
:
verrà inserito il frammento di DNA esogeno
Ottenere copie dello stesso gene:
Clonaggio
1) isolare frammento da duplicare
2) inserire il frammento individuato in un plasmide (utilizzo di enzimi di restrizione prima e DNA ligasi poi)
3) verificare la trasformazione era crescita e selezionare le cellule per ottenere una coltura pura
I geni possono essere isolati a partire dall'RNA messaggero.
Per
amplificare
le sequenze di DNA si utilizza la
PCR
(
reazione a catena della polimerasi
)
per farla avvenire occorrono:
1) DNA stampo (breve frammento o intero genoma)
2) coppia di nucleotidi chiamati
primer
per l'innesco della reazione di polimerizzazione
3) DNA polimeri termoresistente
4) miscela contenente quattro nucleotidi trifosfato necessari alla DNA polimerasi
Primo passaggio della reazione è la
denaturazione
, poi si favorisce la seconda fase con la
rinaturazione
. Nella terza fase (
allungamento
) la DNA polimerasi sintetizza la prima copia della porzione del DNA di partenza.
Per
separare
i frammenti di DNA si utilizza l'
elettroforesi su gel
il DNA è una macromolecola dotata di
carica negativa
(gruppi fosfato)
in un campo elettrico, questo mogra dal polo carico negativamente (catodo) a quello carico positivamente (anodo)
Si utilizzano due polimeri:
Agarosio
: polisaccaride naturale estratto dalle alghe (liquido a 90 gradi, solidifica sotto i 40 gradi
Poliacrilammide
: polimero artificiale, usato per distinguere frammenti più piccoli
Per
Sequenziare
il DNA si utilizza il metodo Sanger
il sequenziamento è la determinazione dell'identità dei nucleotidi presenti in un frammento di DNA nell'ordine in cui si presentano
La
genomica funzionale
è la disciplina che si pone l'obietttivo di identificare tutti i geni di un organismo e di determinarne la funzione
La
bioinformatica
si occupa dell'analisi dei dati biologici
La
genomica comparativa
si occupa del confronto tra il DNA di organismi di specie diverse, per stabilirne le parentele evolutive
La
metagenomica
si occupa dell'analisi dei genomi delle varie specie presenti in un determinato ambiente, per valutarne la variabilità genetica (
biodiversità
)
La
trascrittomica
si occupa di studiare il genoma in azione