Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Modificazione delle proteine (RATIONAL DESIGN / mutazione sito specifica,…
Modificazione delle proteine
RATIONAL DESIGN / mutazione sito specifica
Che cos'è ? e il Principio?
Modificazione mirata
Basata sulla
Conoscenza della struttura
della proteina e la
Conoscenza delle correlazioni
tra i suoi componenti amminoacidici,
Si realizza attraverso
la Mutagenesi
Situ Specifica
o
Diretta
Può interessare
un singolo aa, pochi aa, o un intero dominio della proteina
Possiamo utilizzare SINGOLO FILAMENTO
Come avviene ?
1_Trasformiamo Coli
con
Plasmide Helper
Che porta le
funzioni / geni del fago
necessarie a completare il ciclo fagico
QUINDI :
1_
Co-infezione di Coli col plasmide helper
o il
profago
Che porta in trans le
funzioni accessorie per completare il ciclo fagico
2_
Liberazione
nel surnatante
Un
FAGO col DNA a singolo filamento
3_ Verrà indirizzato il nostro
OLIGO
nucleotide
4_ La
DNAPol (Framento di KLENOW)
Sintetizza il secondo filamento (in presenza di deossinucleotidi trifosfati e ATP e magnesio )
Frammento K LENOW
Frammento Ingegnerizzato,
A cui è stata
privato
2 more items...
5_
T4 ligasi
Che chiude il filamento e con questo filamento trasformiamo Coli
2_Metodo utilizzato è quello di
Kunkel
Si basa su
Ceppi di Coli
Dut - e Ung-;
A_Dut
sta ad indicare una
dUTPasi difettiva
dUTPasi
L'inserimento del UTP nucleotide
(deossinucleotide trifosfato) al posto della
Timina TTP
Enzima
che controlla
Questo accade casualmente
PERò, in Coli questo
Errore viene corretto
Come viene corretto ?
Ad opera della
dUTPasi
che
stacca l’UTP dal DNA neo-sintetizzato
e
consente di Inserire correttamente il TTP
B_Contiene anche una
mutazione Ung-
Interessa l'
Enzima Uracil-N glicosilasi
Questo interviene nella
Correzione degli inserimenti sbagliati di uracile
Quello che fa è di
1 more item...
Perchè uso questo ceppo?
Non per clonare
, ma
per
AMPLIFICARE il vettore
che contiene già il gene di interesse
FASI :
1_
Amplificazione del DNA
Verrà amplificato con un elevato numero di molecole e nt di UTP
2_Ci
purifichiamo questo DNA
3_
Sintetizziamo il secondo filamento
Usando
l’oligonucleotide mutageno
La sintesi
avviene in vitro
quindi con i 4 dNTP e una DNAPol
4_
Quindi produrremo
Un DNA plasmidico ibrido
Il cui
templato
sarà
ricco
di U, mentre
Il
filamento neosintetizzato
sarà
privo
di U
Se con questo DNA trasformiamo un ceppo wild-type di Coli
Otterremo un DNA a doppio filamento contenente la mutazione che abbiamo inserito grazie all’oligo
I due enzimi della correzione (dUTPasi e UracilNglicosilasi) taglieranno il filamento ricco di U e quindi sarà l’altro ad essere replicato
PHAGEMIDI
possono essere trattati
come vettori plasmidici
Grazie alla presenza di
ORI di tipo fagico
Hanno la Capacità di
produrre DNA a singolo filamento
adatto per la mutagenesi.
I Phagemidi come questo derivati da
M13
producono nella cellula
Prevalenza il
filamento +
, .
E con questo poi
Infettiamo un
ceppo vergine di Coli
Otteniamo il doppio filamento
che possiamo trattare come un plasmide
Mediante stratagemmi possiamo produrci anche una frazione di
DNA di filamento -
contenente la nostra mutazione
Se non abbiamo la struttura
possiamo
Possiamo modellarla sulla struttura esistente
di proteine omologhe (Phyre2) in modo da avere almeno un templato
Come avviene la mutagenesi ?
La sequenza codificante la nostra proteina viene clonata in un plasmide
con un
DNA
che funzionare
da Templato
Il templato può essere prodotto :
A forma di
singolo filamento
o in forma di
doppio filamento
come può essere in un plasmide
o possiamo avere un
amplimero
Una sequenza delimitata che possiamo ottenere attraverso PCR,
Disegniamo degli
oligo
(disegnati)
Che permettono di modificare ad hoc la sequenza codificante
Questi
vengono Indirizzati
Al templato
Su cui agire una Polimerasi
per sintetizzare il secondo filamento introdurrà la modifica desiderata
4_Site directed mutagenesi__Pcr
USATA per:
Introdurre dei SITI di restrizione nella sequenza
O per modificare uno o pochi aa.
Come avviene?
PREMESSA
Posto che abbiamo la sequenza già amplificata con degli oligonucleotidi esterni
1_Si disegnano due oligo (primer B e primer C) che
Di fatto sono due
oligo complementari
che contengono la mutazione di interesse
2_ Faccio 2 PCR
Il trucco è utilizzarli
in due PCR diverse e quindi
In due Provette diverse
Una provetta facciamo funzionare il
primer
reverse
insieme al
primer forward
Nell’altra provetta facciamo agire il nostro
primer
mutagenico forward
con un
primer esterno
E quindi in ciascuna delle due provette
si formeranno degli amplificati a partire dai primer mutagenici fino a quelli esterni
3_ PURIFICAZIONE
Ci purifichiamo il prodotto della prima e della seconda PCR,
li misceliamo i Vitro
4_
SE
Utilizziamo
solo i primers esterni
A e D si
ricostruiranno le sequenze mancanti
Perché in questa regione di mutazione i
filamenti prodotti
nell’una e l’altra PCR
saranno in grado di sovrapporsi
Taq Pol
Richiuderà questi GAP
e quindi gli oligonucleotidi esterni ci consentiranno di RI-Amplificare una sequenza con la mutazione di interesse inserita.
3_ Plasmidi DNA e Dpnl endonuclease
è il più rapido
Consiste
1_ USO
Di un
DNA a doppio filamento
a partire da un templato che ci siamo purificati e
Se il
plasmide lo purifichiamo
da un Coli WT
Questo significa che il nostro templato sarà soggetto a metilazione nei siti (5’Gm6ATC3’)
2_PURIFICAZIONE
Dei due filamenti entrambi metilati
3_AMPLIFICAZIONE
Ciascuno con
due oligonucleotidi
che ci sintetizziamo contenenti entrambi la mutazione (fov e rev)
4_ SINTESI
Del secondo filamento sul Templato
I Filamenti NeoSintetizzati in vitro saranno diversi da quelli del templatoi
perché quelli del templato avranno le metilazioni provenienti dalla loro replicazione in Col
5_ DIGESTIONE
Il prodotto viene digerito ad opera
DpnI endonucleasi
Taglierà
dove sono presenti i
siti metilati
questi saranno presenti solo sui filamenti usati come templato
In
soluzione
rimarranno
integri solo i filamenti neosintetizzati
e con questi
trasformeremo Coli
DIRECTED EVOLUTION,
Mimano la natura e quindi l’evoluzione che le proteine hanno subito per eventi naturali
CONSISTE
2_ Creo delle
libreria di enzimi
,le cui
varianti sono elevate
1_ Introduco delle
mutazioni casuali
nella sequenza codificante l’enzima
Mediante una
TaqPol error-prone
(soggette ad errore )
Il
grosso limite
che abbiamo
n° delle varianti che è elevato
quindi il metodo
deve essere efficiente
e
facilmente trasferibile
a sistemi automatizzati
Es- colorimetrico
3_ Selezione mediante
un sistema di screening
Usato quando
non si hanno informazioni sulla struttura
su cui agire
Si basa su 2 metodi :
2_ MUTAGENESI di tipo CAUSALE
RANDOM mutagenesi
Fanno uso di una
error-prone TaqPol
SEMI-RATIONAL mutagenesi
Si
Agisce solo su un segmento
che codifica per un certo dominio
Si deve avere almeno
una minima conoscenza
di informazioni strutturale
1_ METODI di tipo RICOMBINATIVO
ESEMPI
2_ Staggered extention process( STEP)
tipo di mutagenesi
basato su metodi di tipo ricombinativo
Cosa faccio?
1_ Uso dei
primer specifici
per le diverse varianti
2_fate avvenire la
fase di extension (PCR) per tempi
brevissimi
in modo da avere amplificati brevi
3_Questi potranno essere utilizzati in una
seconda PCR
e questi
Brevi amplificati
andranno a
funzionare da primer
per estensione sulle molecole diverse che avete in provetta
4_ Riprendendo questa procedura più
volte otterrete una l
ibreria di geni ibridi
1_ DNA shufflung
Fanno uso di un
Pool di sequenze tra loro omologhe
3_ ottenete una
frammentazione
al fine di avere una serie di
frammenti di grandezza ridotta
4_ questi frammenti li
rimettete insieme
e li
usate come primers
su un templato
2_ Le
digerite in maniera
controllata
con
la DNAsi
1_
mettete insieme
un pool di sequenze
tra loro omologhe.
5_ vi
isolate tutti gli amplificati
che hanno una dimensione finale attigua
Questi deriveranno quindi dall' amplificazione in serie causale dei diversi frammenti
Otteniamo
2 more items...
3_ ITCHY recombiantion
Prevede creazione di una
chimera fra
due geni omologhi
Caratteristiche necessarie per la fusione
è che devono esserci almeno
uno o due siti di restrizione unici
Tagliate in corrispondenza di
questo sito
di restrizione unico
Digestione
ad opera delle
esonucleasi
3 (che digerisce in
posizione 5’->3’)
1_DIGESTIONE
Miscelate
i prodotti ottenuti da
queste aliquote e li
mettete insieme
La
esonucleasi
Produce delle estremità sticky
, si devono chiuderle
2 more items...
A
tempi determinati Prelevate delle aliquote
e bloccate la digestione.
ALTRA COSA
Il
templato
lo avete amplificato in una PCR
In cui oltre
2 more items...
Questi
Oligo Innaturali
1 more item...
Vengono prodotti questa
SERIE DI FRAMMENTI CHE POI saranno LIGATI
Quando
vi siete prodotti il templato di partenza
su cui far agire l'enzima di restrizione poi l'esonucleasi
Fanno uso di
Più sequenze omologhe
per lo stesso enzima.
utilizzato soprattutto quando abbiamo
a disposizione una serie di sequenze codificanti per più enzimi
(Lo stesso Enz proviene da organismi diversi / Enz appartenenti alla stessa famiglia genica di un stesso organismo. )
3_ SATURATION
MUTAGENESIS
Consiste
nel
individuare una certa regione
e
in quella regione, introdurre
tutti le possibili variabili
per ogni aa sostituirlo con tutti e 19
aa possibili
Es_
Random mutagenesis
può essere fatta = Rational mutagenesi
lisozima dell’albume
è una proteina di 129 aa
SE
dovessimo avere una library rappresentativa delle varianti della sequenza primaria
Dovremo avere
20129
cloni da screenarla
Quindi si procede
a cicli ripetuti
di mutagenesi
FASI :
2_ Amplificazione
Mutagenesi Error Prone PCR
e producete una library
con cui trasformate il Coli
3_ Clonazione degli Inserti in un vettore di espressione
si gioca con tutti i parametri chimico fisici in cui avviene l'amplificazione (pH, %Sali, %dNTPs).
Vengono prodotti degli inserti
4_Isolate attraverso sistemi di screening high-throughput
Enzima che ha acquisito un miglioramento
Isolo quel DNA
e
osservo mutazioni introdotte
che hanno permesso di aumentare la resa
fate un
secondo ciclo di mutagenesi
( 3-4 volte) fino ad ottenere un enzima migliore per det. caratteristica
1_Vi producete in
vitro una library
che contiene il
maggior numero di varianti
Es_Random mutagenesis può essere fatta
SEMI-RATIONAL design
Chiamata
SATURATION
mutagenesis
vi focalizzate su alcuni aa della prot
QUINDI FACCIO
Vi
producete tutti gli oligo
Sintetizzare un numero di primer
che coprano tutte le possibili varianti per questi aa
Con questo pool di oligo vi fate una
PCR
con i primer interni e esterni
Ottenete un
prodotto di amplificazione
in cui in corrispondenza di quegli aa ci sono
tutta una serie di varianti
SCREENING
test hoghtroput
Non so come modificarli per migliorare la caratteristica che voglio.
Qualcosa che
sta a meta tra
:
Mutagenesi sito specifica e la Random Mutagenesi
Es_Rational Desing
T4 lisozima
Es_storico perché
uno dei Primi Enzimi
ad essere stato
stabilizzato
attraverso mutagenesi sito specifica
e rational design
Era nota la struttura
dell’enzima
Il
N°di varianti enzimatiche ridotto
Come è avvenuto ?
se era possibile stabilizzare la struttura
introducendo
Individuano
una serie di
posizioni
inseriscono una serie di cisteine
E tengono conto anche di un ponte disolfuro naturalmente presente nella proteina
RISULTATO
l’introduzione di 3 ponti
disolfuro fa
perdere funzionalità
all’enzima
Introduzione di
2 ponti
, l'
attività risulta lievemente ridotta
rispetto alla WT, la
resistenza dell'enzima >
si analizzano i WT / le varianti in cui sono state introdotte le cisteine nelle diverse posizioni / il ponti e la resistenza dell'enzima:
Condizioni
1_ Dei
ponti disolfuro
in posizioni specifiche della proteina in cui
2_ Queste
Cisteine
non interferissero
il sito catalitico
altrimenti l'enzima perdeva la sua attività e
che
Non alterassero
la struttura
3_ I
residui aa
da modificare
Avessero una distanza compatibile
con la creazione del ponte disolfuro tra i 3' delle cisteine introdotte
Gli autori si sono chiesti:
Es_ Lattato deidrogenasi
Enzima che viene utilizzato nella sintesi di PLA
Il problema è
I microbi
usano NAD fosfato
, e
L'
enzima nativo
usa come cofattore il
NADH
Cosa hanno fatto ?
Hanno preso la sequenza della
di-lattato deidrogenasi
hanno provato a
modificare la preferenza per il cofattore
Come?
Avevano la sequenza 1°
L'hanno sovrapposta a sequenze già note
di Gliossilato Reduttasi nel quale si sapeva che il
sito catalitico era molto simile
Individuano
3 aa
che potrebbero essere utili a consentire l’utilizzo del NADPH al posto del NADH.
FASI :
1_
Clonano l'enzima in Coli
e ne
producono le varianti
mediante mutagenesi situ specifica
2_ Vanno a
valutare la
produzione di D-lattato
in Coli.
è maggiore
Ceppo di Coli che produce la
variante mutagenizzata
Queste
3 mutazioni
predette da analisi computazionali
Oltre a consentire all
'enzima di produrre il D-LDH
nel microorganismo e quindi
utilizzando il NADPH
Riescono a far
Aumentare l’Attività Catalitica dell’enzima di 184 volte.
INTEINE
Caratteristiche
Funzione
Purificazione
delle prot ricombinanti
Enzimi che fanno
Autocatalisi
Vengono Tradotte in Fusione
come un unica proteina con queste
la
Porzione Interna
è detta
INTEINA
2 regioni Exteine
(
C
-exteina e
N-
exteina)
Identificate originariamente in Cerevisiae e Cyanobatterio Synechocistis
Hanno la capacità di
autoexcidersi
Da un
polipeptide più lungo
al cui interno si trovano
E' una forma di
modificazione post traduzionale
Classi
Si dividono in
3 classi
a seconda del
primo amminoacido coinvolto nella reazione
1°classe
Homing endonucleasi
Studiate sprattutto per il loro ruolo nel corso dell'evoluzione del
trasferimento di segmenti di DNA .
è una strategia di successo per garantire la sopravvivenza a lungo termine di un elemento genetico all'interno delle popolazioni naturali. (Es.
batterio ancestrale
dal quale si è originato il cloroplasto o mitocondrio verso il nucleo)
Cosa sono ?
Sono una classe distinta di endonucleasi del DNA sito-specifica
Funzioni
Promuovono il
taglio
e il
Trasferimento Laterale
della regione codificante il DNA
Come?
Mediante un processo
catalizzato
da un'endonucleasi che riconosce e
taglia il DNA a singolo filamento
in un
sito specifico
(12-18nc)
Tappe che caratterizzanti dell'AutoCatalisi
2_ Una
TransEsterificazione,
l'Estere (tio)
viene scisso
attraverso un attacco nucleofilo dal residuo situato nella giunzione e C-terminale.
Si genera un secondo
intermedio proteico ramificato
3_ Si ha una
ciclizzazione dell'asparagina
L' inteina viene Asportata e le 2 Exteine sono giuntate tramite un legame estere.
4_
Riarrangiamento spontaneo
Inteina libera
La
proteina matura
Se
Mutiamo
questi aa possiamo
scegliere
se staccare l’inteina al su N o al suo C term
Porta alla formazione di un
legame peptidico
tra i due domini di Extein.
La
reazione catalitica avviene in 4 fasi
In cui l'Inteina
viene escissa
dalle due regioni amminoacidiche fiancheggianti, che sono collegate da un
legame peptidico
1a_
Identificazione degli amminoacidi
conservati per iniziare la reazione
Usano
il residuo Ser o Cys
conservato che si trova nella giunzione tra il N-extein
1b_
L'attivazione
della giunzione
N-terminale
Mediante uno
spostamento N-O o N-S
Porta alla formazione di un
intermedio Estere
( serina) o
tioestere
(cisteina)
La struttura dell'Inteina
Conserva delle
Regioni conservate
importanti perchè
avvenga il meccanismo di autocatalisi
sono
il dominio
C-splicing
generalmente troviamo il residuo His-Asn o His-Gln
Un
dominio Exteine
è la
sequenze fiancheggiante
le due estremità del dominio intein,
Cisteina/ Serina o Treonina amminoacido conservato all'ammino termianle
e un dominio
N-splicing
dove troviamo come primo residuo un
Ser o Cys
E blocchi nella regione consensus del dominio di splicing nella regione N o C terminale dell'inteina
Classe II e III mancano del residuo Ser o Cys e di conseguenza sono stati proposti meccanismi alternativi per queste inteine.
Che cos'è ?
Sono delle proteine con funzione autocatalitica, che viene usato come
TEG
Trascritto e tradotto insieme con le proteine
Appartengono alla classe di enzimi Autocatalitici
Strategie di purificazione delle prot
1_ Uso dei TAG
Ci mettiamo nelle
condizioni con cui avviene la catalisi
basate sull'uso
Condizioni
Riducenti del tampone°
oppure altro caso
pH acido e T° elevate
IMPACT CN system
Si avvale del dominio di legame alla chitina (CBD) come tag di affinità
Uso di una Colonna di affinità possiamo isolare il nostro prodotto (proteina chitina legata alla resina)
Commercio vari kit di purificazione di proteine a base di inteina
Nell'approccio classico
Dopo la purificazione si usa una resina di affinità specifica per il TAG
,
l'Inteina è
inserita tra
la proteina
bersaglio
e il
tag
di purificazione.
Es_
Usate per purificare prot tossiche
difficile da produrre in Coli
2_ Si
purificava
questo
prodotto di fusione
e
3_ dopodiché in vitro si
faceva avvenire la catalisi
e si otteneva
la purificazione della proteina
tossica
1_La
proteina tossica
veniva
prodotta
in due diversi domini
Es_ Produrre peptidi ciclici
I metodi chimici classici non sono in grado
di riprodurre facilmente tali modifiche
Inteins, al contrario,
è un approccio più economico
Permette di Evitando gli inconvenienti
associati alle legature chimiche classiche
L'unico prob è produrli ed indirizzarli al tessuto su cui devono agire
Producono le proteine direttamente in un organismo ospite utilizzando un processo chiamato
intein-mediated protein ligation (IPL)
Vengono indirizzati al tessuto patologico/ Sono molto stabili
e lì se si riesce a fare esprimere la proteina/ opp per via ricombinante e lo si inietta selettivamente nel tessuto, questi peptidi ciclici svolgono il loro ruolo
Vengono prodotti dei farmaci proApoptotici
Il sistema di ciclizzazione si basa
Sulla costruzione di una proteina di fusione in cui avete
e al carbossi terminale della prot di fusione avete la regione l’N-term dell’inteina
il pept ciclico al centro mentre
da un lato all’Ammino-term avete la regione carbossi termianale della cisteina
e queste 2 regioni tendono a ciclicizzare in condizioni a pH acido oppure in condizioni riducenti
Quello che succede è che l'inteina si stacca e si ricompone e il prodotto interno di fatto ciclizza
Elastin like
polipetide ( ELP.)
Si tratta di
ripetizioni di sequenze consensus
caratteristiche che si trovano naturalmente in proteine con proprietà elastiche come l’elastina
Sono
responsabili della caratteristica della proteina
Con
filament
i che possono aggregare mantenendo la
forma a spirale
oppure a temperature più elevate
aggregano
di
subire deformazioni
che gli permette di passare da random coil a forma spiralizzata
E nel caso degli ELP
la sequenza consensus che viene ripetuta n° volte nel polipeptide è ValinaProlinaGlicinaX(detto aa ospite, guest residue) Glicina
guest residue = può essere qualsiasi aa tranne prolina
Cosa interessante
Dallo studio è stato scoperto che subiscono una
transizione di fase reversibile
in funzione della T°(oltre ad una det T° si ha la formazione di aggregati )
da aggregato può tornare alla struttura iniziale raffreddando il sistema
La temperatura di transizione è regolata
dal guest residue