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基因轉殖及基因剔除技術, 10941027A黃宇菡 10941047A黃宥誠, 10941016曾宜萱, 10941048 陳胥辰,…

- - - - 在生物體中存在有多種小型的DNA跳躍子，可以插入基因體中的任何位置。
      - 其最早是在玉米中發現的，它可以造成隨機的紫色玉米粒，每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶(transposase)對跳躍子兩端的跳躍元素(transposable element)作用，讓它在特別的序列中跳進跳出。
      - 利用跳躍子的這種特性，不但可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞，只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題，比起化學或物理性的破壞更容易定出位置
      - 而跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選。
      - 這種技術在果蠅等實驗動物中均行之有年，在哺乳類動物中卻十分困難，雖然哺乳類基因體中有各種跳躍子，約佔基因體的40%區域，但在5千萬年前即不再跳動了。
      - 近幾年才有適合的跳躍子成功地在人類細胞及小鼠的基因體中跳躍。
      - 這些跳躍子最大的特色是沒有特定的宿主，異於以往對跳躍子的認知。
    - - 這是原本在鮭魚基因體中的跳躍子，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般。
      - 在1997年，科學家們將其改造，如同甦醒的睡美人，可以在人類細胞株基因體中再跳躍。
      - 2005年，科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選，當基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後，後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置，SB的插入位置是TA序列。
      - 由於小鼠體內原本沒有這種跳躍子，因此很容易就找出位置，當跳躍酶不存在的狀況下，SB即不再跳躍。
      - 但目前而言，它的跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變，目前有改良的跳躍酶(SB11)基因，可產生更大量的跳躍酶，配合更多的連續SB (T2/onc2)，而在基因體中可以跳得更多更廣。
      - 此外，它所跳躍的範圍仍靠近原本的位置，這些都可能在逐一研究之後慢慢改良。
    - - 這是原本在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA，在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入，而且沒有特定的區域，只需要是TTAA序列；相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍。
      - 2005年，中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統，成為小鼠突變株篩選的另一個更有潛力的新工具。
      - 除此之外，這些非病毒攜帶的跳躍子不會引起病毒插入基因體所造成的種種影響，可能有機會取代病毒載體成為基因治療的新一代載體。
- - - - 產生基因轉殖小鼠：
      - 以基因選殖方式得到我們要的轉殖基因株後，再把轉殖基因DNA片段從質體分離純化出來，以顯微注射(microinjection)之方式把轉殖基因DNA打入單細胞之受精卵，再將此受精卵送回至假懷孕之母鼠子宮內，19~20天之後即可生出小鼠。
      - 打入受精卵之轉殖基因DNA會隨機地插入染色體的任何一個位置，並隨著染色體進行複製而遺傳至小鼠體內的每一個細胞，如此便得到基因轉殖小鼠(transgenic mice)，此段外來之DNA也就稱為轉殖基因(transgene)。
    - - 篩選基因轉殖小鼠：
      - 要篩選轉殖成功之小鼠，首先要取得小鼠之基因體DNA (genomic DNA)。
      - 我們可以剪一小段約0.5公分之小鼠尾巴，即可純化出夠做篩選之基因體DNA。
      - 最常見之篩選方式是利用PCR技術，設計一組可特異地增幅出屬於轉殖基因部分序列的引子，即可以此方式篩選出帶有轉殖基因之小鼠。
      - 另外，也可以南方墨點實驗(Southern blot)來偵測轉殖基因，只要以轉殖基因當作探針，即可在轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段，而且以此方式更可計算出有多少套數(copy number)的轉殖基因。
      - 轉殖基因的套數太多，反而會抑制轉殖基因的表現，因此轉殖基因的套數對轉殖基因的表現是一項重要的資訊。
- - - - 促濾泡激素及促黃體激素
- - - - (一) 設計標的載體(Targeting Vector)
        
        和ES細胞同源的兩段標的基因序列。
        
        一個放在兩端同源序列中間的正向篩選標記(positive selection mark)
        
        此方法要篩選帶有neo的ES細胞，故neo叫做正向篩選標記。
        
        篩選方式是在培養ES細胞的培養液內加入G418藥劑，G418會抑制蛋白質的合成，造成細胞死亡，而neo基因之產物可將G418代謝成無毒之形式，因此帶有neo之細胞即可存活在含有G418的培養液中。
        
        常用的標記是抗新黴素基因(Neomycin-resistance，簡稱neo)。
        
        一個放在兩段同源序列外的負向篩選標記(negative selection marker)
        
        常用的標記有胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）或白喉毒素（diphtheria toxin，簡稱DT）。
        
        使用TK標記的原理是，若培養液內含有核酸類似物gancyclovir，TK蛋白會將gancyclovir磷酸化，細胞的DNA聚合酶若使用這種不正常之核苷，會使DNA合成中斷，因此會表現TK的細胞無法存活在含有gancyclovir的培養液中；而DT是一種蛋白毒素，會抑制真核細胞的蛋白質合成，若細胞會表現DT，就會殺死自己。
        
        負向篩選標記的目的是要篩選不帶有TK或DT的ES細胞。
      - (二)產生發生同源重組(或是基因剔除)之ES細胞
        
        構築好標的載體後，一般是以效率較高之電穿孔(electroporation)方式將標的載體送入ES細胞中。
        
        為了篩選帶有標的載體之ES細胞，我們可以G418來篩選帶有neo的ES細胞。
        
        可是送入ES細胞之DNA大部分是以隨機的方法插入染色體內，此ES細胞就會同時帶有neo和TK或DT標記，這並不是我們要的ES細胞，但G418藥劑不會殺死這些細胞。
        我們要的是兩段同源序列同時發生重組，如此被破壞的基因才會被置換入染色體的同源位置，此種ES細胞是帶有neo但不帶有TK或DT。
        
        同時利用正向和負向篩選標記（同時在培養液中加入G418和gancyclovir，若是使用DT，只加G418即可），便可篩選出有同源重組之ES細胞。
        
        這種改變特定染色體基因的方法，就叫做基因標的法(gene targeting)。
        
        如果是造成基因功能破壞之改變，就叫做基因剔除(gene knock-out)。
      - (三)篩選發生同源重組(或基因剔除)之ES細胞
        
        正向和負向篩選標記可以幫助挑出發生同源重組之ES細胞，但這些篩選標記的效果並不是百分之百，因此需要以南方墨點實驗進一步篩選確認有同源重組之ES細胞。
        
        作法是在設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
        
        PCR也可用來篩選有同源重組之ES細胞，其引子之設計是一個位於neo內，另一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上，如此才可分辨出是非同源重組之ES細胞（做不出PCR產物），或是同源重組（可做出PCR產物）。
      - (四)產生基因剔除小鼠
        
        得到基因剔除之ES細胞後，將此ES細胞以顯微注射打入囊胚(blastocyst)，再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內，ES細胞（灰色）會和野生型之囊胚細胞（黑色）混合，發育生長成一個混合之個體，稱為嵌合體(chimera)。
        
        ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因(Agouti)，囊胚細胞帶有隱性黑色毛色基因(nonagouti)，而ES細胞可分化成任一個細胞，因此產生之嵌合小鼠(chimeric mice)身上的毛色有可能是黑色，也有可能是非黑色。
        
        可以用非黑色毛色的比例來判斷ES細胞發育成生殖細胞的機率，因為如果非黑色毛色越多，代表ES細胞佔嵌合體的比例越大，ES細胞發育成生殖細胞的機率就越大，如此可將剔除之基因遺傳至後代的機會也就越大。
        
        經由和ES細胞同樣的篩選方法來篩選嵌合小鼠之後代（如南方墨點實驗或PCR），得到單套基因剔除小鼠(heterozygous gene knock-out mice)後，再使其互相交配，即可有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠(homozygous gene knock-out mice)。
    - - 條件性基因剔除(Conditional Gene Knock-Out)
        
        一般產生之基因剔除小鼠是將小鼠身上每一個細胞的某一基因完全破壞掉，但常常我們將基因破壞掉之後，會造成小鼠在胚胎時期即已死亡，這會造成研究上的困難。
        
        如果我們可以只在小鼠發育的某個時期，或是只在小鼠的某個組織內做基因剔除，不僅可以減少胚胎時期小鼠死亡之機率，也可以特定地研究此基因在某發育時期或某組織內之重要性。做到特定發育時期或特定組織之基因剔除，就必須利用到Cre-loxP系統。
        
        Cre可以特定地認得loxP序列，若有兩個loxP是同方向的，Cre會把兩個loxP中間之序列刪除，留下一個loxP；若兩個loxP是反方向的，Cre會把兩個loxP中間之序列做倒轉。
        
        Cre是P1噬菌體的重組酶(recombinase)，loxP是一組含有34個特定核苷酸之序列，且具有方向性。
        
        除了Cre-loxP系統外，另有一相同原理之系統是從酵母菌而來，叫做Flp-FRT系統。
        
        首先要有一個由特定啟動子控制之Cre重組酶的基因轉殖小鼠，此特定啟動子是依需要而定，我們可選擇只在某特定發育時期或只在某特定組織表現之啟動子。
        
        我們還需重新設計標的載體，為了篩選正確之ES細胞，標的載體必須含有正向及負向篩選標記，其中只有正向篩選標記會留在標的基因內，為了不使正向篩選標記影響基因表現，我們可將正向篩選標記放在內子∕插入序列(intron)內，以減少對基因表現之影響，然後再將兩個同方向之loxP放在標的基因之重要外子∕表現序列(exon)的兩旁，以此標的載體利用上述基因標的法產生之小鼠，稱為loxP小鼠。
        
        當我們已各別產生Cre轉殖鼠和loxP小鼠後，再使其互相交配產生同時含有Cre及loxP的小鼠，在此小鼠身上，Cre在特定啟動子的控制下，表現在特定的時間或是組織後便會將兩個loxP中間之序列剔除，就可得到特定發育時期或特定組織之基因剔除小鼠，這種方式稱為條件性基因剔除(conditional gene knock-out)。