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生物技術概論, 10941058A, 10941058A, 10941024A, 10941024A, 10941005A, 10941005A,…

- - - - 體積小（一隻成鼠約為30〜40克）
      - 壽命為1.5〜2.5年
      - 一年四季皆可繁殖
      - 妊娠所需的時間為19〜20天
      - 每胎約可產生6〜8隻幼鼠
      - 6週大的小鼠即性成熟
      - 在哺乳類動物中,較適合作為研究的實驗動物
      - 母鼠的生理週期
        
        受到促濾泡激素（follicle-stimulating hormone，簡稱FSH）以及促黃體激素（Iuteinizing hormone，簡稱LH）的控制
        
        最佳的狀況下
        
        生理週期為4天
        
        每次排8〜12個卵
        
        如果以懷孕母馬血清性腺激素（pregnant mare's serum gonadotropin，簡稱PMSG）和人類絨毛膜性腺激素（human chorionic gonadotropine，簡稱hCG）來代替FSH和LH之功能
        
        施打於4-6週之母鼠
        
        促使其大量排卵
        
        每次約可排出20〜30個卵
        
        基因轉殖和基因剔除技術
        
        需要利用到很多的受精卵及胚胎
        
        使母鼠大量排卵
        
        減輕收集受精卵和胚胎的工作量
        
        需要用到假懷孕之母鼠
        
        假懷孕之母鼠
        
        指正常母鼠和不孕公鼠交配後，其子宮會變化成適合使受精卵著床的狀況，但因公鼠不孕，故母鼠之卵子無法受精，此母鼠即為假懷孕
        
        圖8-1
        
        正常情況下小鼠是在半夜交配
        
        若受精成功
        
        交配後第一天中午之受精為交配後第0.5天（0.5 day post-coitum，簡稱0.5dpc）
        
        如圖8-1
        
        早期胚胎發育得很慢
        
        受精後第0.5〜2.5為天為分裂期
        
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        受精後第35天為囊胚期
        
        胚胎之細胞開始分化
        
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        第4.5天時胚胎會著床至子宮內膜
        
        胚胎發育進入原腸胚形成（gastrulation）
        
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        至第19.5天發育成一完整個體
- - - - 1.設計轉殖基因
        
        需要有啟動子(promoter)和編碼區域(coding region)，啟動子可控制基因的表現，編碼區域則可經轉錄和轉譯過程產生蛋白質
      - 2.產生基因轉殖小鼠
        
        以基因選質的方法，得到轉殖基因株後，在把基因轉殖片段從質體中純化出來
        
        用顯微注射(microinjection)的方式將基因轉殖DNA打入單細胞之受精卵，再將受精卵送回母鼠子宮內，打入的受精卵之轉殖基因DNA會隨機插入染色體中任一位置，隨染色體的複製而進行遺傳至小鼠每個細胞
        
        得到基因轉殖小鼠(transgenic mice)
        外來的DNA片段稱為基因轉殖(transgene)
      - 3.篩選基因轉殖小鼠
        
        剪一段小鼠的尾巴約0.5公分，即可得到純化能夠做篩選的基因體DNA
        
        常用方法為PCR和南方墨點實驗
        
        PCR:設計出一組可特異增幅出屬於基因轉殖部分序列的引子，即可篩選出帶有基因轉殖的小鼠
        
        南方墨點實驗:以轉殖基因當探針，即可在轉漬膜上測出含有基因轉殖的片段
    - - 轉殖基因的表現受許多因素影響，如果轉殖基因插入之位置附近有靜默子(silencer)或加強子(enhancer)，這些都會影響轉殖基因的表現，會促進或抑制轉殖基因的表現。
        
        1.轉殖基因插入染色體之位置
        
        轉殖基因插入之位置附近有靜默子(silencer)或加強子(enhancer)，都會影響轉殖基因的表現，促進或抑制。
        
        2.轉殖基因套數
        
        研究發現轉殖基因DNA片段多是以頭尾相連的多套形式，若轉殖基因的套數太多，會抑制轉殖基因的表現，但真正之原理目前並不清楚。
    - - 要研究一基因之啟動子區域，我們可在此啟動子後接上一報告者基因(reporter gene)，便可以報告者基因之表現量多寡來代表待研究之啟動子之強弱。
      - 分析一基因之產物，可在此基因前接特定之啟動子（視研究者需要而定），例如:選用只在某組織表現的啟動子，便可研究此基因在某組織表現會有何影響。
      - 此外也可在基因本身作定點突變，藉此在動物體內研究此突變對基因之產物的功能有何影響，或是此突變之產物對實驗動物會造成何種生理之改變。
- - - - 能夠製造出基因剔除小鼠的兩個重要條件是ES細胞之培養和基因之同源重組(homologous recombination)。
        
        ES細胞是尚未分化之細胞，若將之混入早期未分化之胚胎中，ES細胞可以分化成身體的任何一種細胞，包括了能將遺傳物質傳給下一代的生殖細胞(germ cell)，因此如果我們在ES細胞的遺傳物質上做改變，此改變之遺傳物質便有可能因ES細胞可分化成生殖細胞，而傳至下一代。
        
        至於要如何改造遺傳物質，主要是利用同源重組的原理，在細胞內，兩段相似或是一致之DNA序列，可以產生重組(recombination)，也就是DNA互相交換，如圖8-3(a)，如果在某片段的兩端都產生重組
        
        一、基因剔除小鼠之製造流程
        
        (三) 篩選發生同源重組（或是基因剔除）之ES細胞
        
        南方墨點實驗進一步篩選確認有同源重組之ES細胞，
        做法是在設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
        
        設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
        
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        (二) 產生發生同源重組（或是基因剔除）之ES細胞
        
        構築好標的載體後，一般是以效率較高之電穿孔(electroporation)方式將標的載體送入ES細胞中。為了篩選帶有標的載體之ES細胞，我們可以G418來篩選帶有neo的ES細胞。可是送入ES細胞之DNA大部分是以隨機的方法插入染色體內，此ES細胞就會同時帶有neo和TK或DT標記，這並不是我們要的ES細胞，但G418藥劑不會殺死這些細胞。
        
        利用正向和負向篩選標記（同時在培養液中加入G418和gancyclovir，若是使用DT，只加G418即可），便可篩選出有同源重組之ES細胞。
        這種改變特定染色體基因的方法，就叫做基因標的法(gene targeting)；而如果是造成基因功能破壞之改變，就叫做基因剔除(gene knock-out)。
        
        (四) 產生基因剔除小鼠
        
        (一) 設計標的載體(Targeting Vector)
        
        標的載體主要包含了三個要素
        
        和ES細胞同源的兩段標的基因序列。
        
        一個放在兩段同源序列中間的正向篩選標記(positive selection marker)
        
        一般都是使用抗藥性基因，常用的標記為抗新黴素基因（Neomycin-resistance，簡稱neo）
        
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        一個放在兩段同源序列外的負向篩選標記(negative selection marker)
        
        使用TK標記的原理是，若培養液內含有核酸類似物gancyclovir，TK蛋白會將gancyclovir磷酸化，細胞的DNA聚合酶若使用這種不正常之核苷，會使DNA合成中斷，因此會表現TK的細胞無法存活在含有gancyclovir的培養液中；而DT是一種蛋白毒素，會抑制真核細胞的蛋白質合成，若細胞會表現DT，就會殺死自己。
        
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        二、應用
        
        條件性基因剔除 (Conditional Gene Knock-Out)
- - - - 將基因完全破壞掉
      - 先將一已知基因以插入抗藥性基因片段(neo)方式置換掉基因，再研究此基因所影響之功能
    - - 某基因之編碼區域內加上外來基因之編碼序列，使外來基因之表現可受此基因之啟動子所調控
    - - 做點突變
        
        若點突變是位在啟動子區域，可研究調控因子對基因表現之重要性；若點突變是位在編碼區域，而造成基因產物蛋白質的突變，則可研究蛋白質之突變對其功能有何影響。
    - - 一、ENU (n-ethyl-n-nitrosourea)
        
        一種很有效率的突變劑，可以對DNA產生破壞，在基因體上會造成隨機的點突變，因此將ENU打入小鼠之生殖器官，可引發其生殖細胞產生基因突變，藉此可產生大量不同的突變鼠，然後再依突變表現型(phenotype)進行分類與篩選
        
        ENU突變鼠計畫需要用到的資源及人力是非常的龐大，因此目前此計畫多是以整合型計畫實行，也就是以研究單位為主
        
        臺灣也在民國90年由中研院成立基因體蛋白體中心之一環－基因突變鼠核心實驗室(Mouse Mutagenesis Program Core Facility)。
        
        主要進行製造突變鼠、建立快速疾病表現型的篩選方法，藉此幫助各個研究單位找出人類疾病的相關基因、建立疾病之動物模式，以開發出與疾病相關之預防和治療方法，並藉此帶動臺灣基因科技醫藥產業。
      - 二、DNA跳躍子(Transposon)
        
        在生物體中存在有多種小型的DNA跳躍子，可以插入基因體中的任何位置。
        
        其最早是在玉米中發現的，可造成隨機的紫色玉米粒，每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶(transposase)對跳躍子兩端的跳躍元素(transposable element)作用，讓它在特別的序列中跳進跳出。
        
        利用跳躍子的這種特性，不但可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞，只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題，比起化學或物理性的破壞更容易定出位置。
        
        而跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選。
        
        這些跳躍子最大的特色是沒有特定的宿主，異於以往對跳躍子的認知。
        
        睡美人跳躍子（sleeping beauty，簡稱SB）：
        
        這是原本在鮭魚基因體中的跳躍子，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般。
        
        在1997年，科學家們將其改造，如同甦醒的睡美人，可以在人類細胞株基因體中再跳躍。
        
        2005年，科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選，當基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後，後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置，SB的插入位置是TA序列。
        
        由於小鼠體內原本沒有這種跳躍子，因此很容易就找出位置，當跳躍酶不存在的狀況下，SB即不再跳躍。
        
        但目前而言，它的跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變，目前有改良的跳躍酶(SB11)基因，可產生更大量的跳躍酶，配合更多的連續SB (T2/onc2)，而在基因體中可以跳得更多更廣。
        
        PB跳躍子（PiggyBac，簡稱PB）：
        
        原本在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA，在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入，而且沒有特定的區域，只需要是TTAA序列；相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍。
        
        2005年，中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統，成為小鼠突變株篩選的另一個更有潛力的新工具。
        
        這些非病毒攜帶的跳躍子不會引起病毒插入基因體所造成的種種影響，可能有機會取代病毒載體成為基因治療的新一代載體。