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基因轉殖及基因剃除技術 - Coggle Diagram

- - - - 轉殖基因之套數
        
        太多
        
        抑制其表現
        
        但原因未知
      - 插入染色體之位置
        
        如果附近有靜默子(sliencer)或加強子(enhencer)
        
        促進或抑制其表現
    - - 難以控制其表現
        
        需要多個結果
      - 轉殖基因常有異位性表現(ectopic expression)
  - - - PCR技術:設計一組可特異地增幅出屬於轉殖基因部分序列的引子，即可以此方式篩選出帶有轉殖基因之小鼠。
      - 南方點墨實驗(Southern blot):以轉殖基因當作探針，即可再轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段，以此方式更可計算出有多少套數(copy number)的轉殖基因。
      - 統計結果發現，如果轉殖基因的套數太多，反而會抑制轉殖基因的表現，因此轉殖基因的套數對轉殖基因的表現是一項重要的資訊。
  - - - 方式
        
        在此啟動子後接上一報告者基因(reporter gene)
      - 目的
        
        以報告者基因之表現量多寡來代表待研究之啟動子之強弱
    - - 方式
        
        可在此基因前接特定之啟動子（視研究者需要而定）
      - 例子
        
        選用只在肝組織表現之啟動子，如此便可研究此基因在肝組織表現會有何影響。
    - - 方式
        
        在基因本身作定點突變
- - - - 促濾泡激素
      - 促黃體激素
    - - 懷孕母馬血清性腺激素
        
        可促使大量排軟
      - 人類絨毛膜性腺激素
- - - - 將標的載體送入ES細胞中
        
        方式
        
        電穿孔(electroporation)
        
        目標
        
        製造出發生同源重組（或是基因剔除）之ES細胞
      - 篩選
        
        方式
        
        同時利用正向和負向篩選標記
        
        同時在培養液中加入G418和gancyclovir
        
        *若是使用DT，只加G418即可
        
        目標
        
        得到真正重組的ES細胞
        
        名稱
        
        基因標的法(gene targeting)
        
        改變特定染色體基因的方法
    - - 南方墨點實驗
        
        原理
        
        設計限制酶切割位置
        
        設計標的載體
        
        用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA
        
        利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞
        
        步驟
        
        一個切割位置位於標的載體一端以外之標的基因序列上，
        一個切割位置位於neo另一邊之標的序列上
        
        利用標的載體以外之標的基因序列作為探針
        
        偵測到的片段是6 kb
        
        推測是多了neo，是有同源重組之基因體結構
        
        偵測不到任何片段
        
        推測是使用標的載體以外之標的基因序列作為探針，
        是隨機插入
        
        偵測到之片段是4 kb
        
        是原來的基因體結構
        
        得到單套基因剔除小鼠
        
        使其互相交配
        
        有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠
      - PCR
        
        分辨
        
        可做出PCR產物
        
        是同源重組之ES細胞
        
        做不出PCR產物
        
        是非同源重組之ES細胞
        
        原理
        
        引子設計
        
        位於neo內
        
        位於用作標的載體以外之標的基因序列上
        
        得到單套基因剔除小鼠
        
        使其互相交配
        
        有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠
    - - 放在兩段同源序列
        
        中間的正向篩選標記(positive selection marker)
        
        常用的標記
        
        抗新黴素基因（Neomycin-resistance，簡稱neo）
        
        將正向篩選標記放在內子∕插入序列(intron)內
        
        目的
        
        減少marker對基因表現之影響
        
        篩選之方式
        
        在培養液內加入G418藥劑
        
        一般細胞
        
        因蛋白質合成被抑制，而造成其死亡
        
        neo之細胞
        
        neo基因之產物可將G418代謝成無毒之形式，
        因此帶有neo之細胞即可存活
        
        外的負向篩選標記(negative selection marker)
        
        常用的標記
        
        胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）
        
        白喉毒素（diphtheria toxin，簡稱DT）
        
        篩選之方式
        
        在培養液內加入含有核酸類似物gancyclovir
        
        表現TK的細胞無法存活在含有gancyclovir的培養液中
        
        細胞會表現DT，就會殺死自己。-抑制真核細胞的蛋白質合成
      - 圖示
      - 和ES細胞同源的兩段標的基因序列。
      - 整合（方式）
        
        設計將基因的重要部位或是大部分的編碼區域刪除，以neo代替
        
        將neo插入編碼區域中，藉以破壞基因之表現
    - - 原理
        
        ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因(Agouti)
        
        囊胚細胞帶有隱性黑色毛色基因(nonagouti)
        
        ES細胞可分化成任一個細胞
        
        產生之嵌合小鼠(chimeric mice)
        
        毛色
        
        2 more items...
      - 步驟
        
        ES細胞和囊胚混合後可產生嵌合小鼠
        
        ES細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞
        
        嵌合小鼠和野生型黑毛小鼠交配
        
        產生非黑色小鼠(ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因)
        
        囊胚細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞
        
        生出黑毛小鼠(囊胚帶有黑色毛色基因)
        
        以非黑色毛色的比例來判斷ES細胞發育成生殖細胞的機率
        
        非黑色毛色越多
        
        ES細胞佔嵌合體的比例越大
        
        ES細胞發育成生殖細胞的機率越大
        
        可將剔除之基因遺傳至後代的機會越大
  - - - 原因
        
        一般產生之基因剔除小鼠是將小鼠身上每一個細胞的某一基因完全破壞掉，但常常我們將基因破壞掉之後，會造成小鼠在胚胎時期即已死亡，這會造成研究上的困難。
      - 原理
        
        利用Cre-loxP系統，在小鼠發育的某個時期，或是在小鼠的某個組織內做基因剔除
      - 步驟
        
        有一個由特定啟動子控制之Cre重組酶的基因轉殖小鼠(1)
        
        重新設計標的載體
        
        將正向篩選標記放在內子∕插入序列(intron)內
        
        將兩個同方向之loxP放在標的基因之重要外子∕表現序列(exon)的兩旁
        
        產生loxP小鼠(2)
        
        使(1)(2)互相交配產生同時含有Cre及loxP的小鼠(3)
        
        在(3)小鼠身上，Cre在特定啟動子的控制下，表現在特定的時間或是組織後便會將兩個loxP中間的序列剔除
        
        得到特定發育時期或特定組織之基因剔除小鼠
      - 應用
        
        利用受特定藥物或荷爾蒙控制表現之啟動子來表現Cre
      - 目的
        
        減少胚胎時期小鼠死亡之機率
        
        特定地研究此基因在某發育時期或某組織內之重要性。
- - - - 在身體中存在可以插入基因體的任何位置
    - - 玉米
        
        他可以造成隨機的紫色玉米粒
    - - 每一種跳躍子都需要一種相對地跳躍酶對跳躍子兩端的跳躍元素
        
        在特別的序列跳進跳出
    - - 利用特性可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞
        
        招出跳躍子的位置就知道哪一個因出問題
      - 跳躍元素可攜帶其他標記基因
        
        可進行大規模的篩選
        
        在果蠅等實驗動物中均行之有年
        
        在哺乳類生物十分困難
        
        跳躍子在哺乳類基因體佔0.4的區域
        
        但在5千萬年前就不在跳躍
        
        近幾年才有合適的跳躍子成功在人類細胞及小鼠基因體中跳躍
        
        特色
        
        1 more item...
    - - 睡美人跳躍子
        
        鮭魚基因體中的跳躍子
        
        1400萬年前不在跳躍
        
        1997年將他改造
        
        2005年成功進行的突變選
        
        插入位置為TA序列
        
        目前跳躍平率不高
        
        跳躍範圍仍靠近原本的位置
      - PB跳躍子
        
        菜額基因體中
        
        可攜帶14KB的 DNA
        
        在果蠅等生物可以任意跳躍
        
        無特別的區域
        
        只要TTAA序列
        
        2005年復旦大學講尺系統成功
        
        成為小鼠突變株塞選
        
        不會引起病毒差入基因體影響