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Ch8基因轉殖及基因剔除技術 - Coggle Diagram

- - - - 以基因選殖方法得到我們要的轉殖基因株後,再把轉殖基因DNA片段從質體分離純化出來
      - 1.設計轉殖基因2.將轉殖基因以顯微注射打入受精卵的核3.將受精卵送入假懷孕母鼠子宮4.出生之後5.以PCR或南方墨點實驗篩選出基因轉殖小鼠
    - - PCR技術
        
        設計一組可特意遞增幅出屬於轉殖基因部分序列的引子,即可以此方式篩選出帶有轉殖基因的小鼠
      - 南方墨點實驗(Southern Blot)
        
        以轉殖基因當作探針,即可再轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段,而且可以計算出有多少套數(copy number)的轉殖基因
    - - 轉殖基因要包含啟動子(promoter)和編碼區域(coding region)
- - - - 一般產生之基因剔除小鼠是將身上每一細胞的某一基因完全破壞，但這會造成小鼠在胚胎時期死亡，造成研究困難，因此，如果可以只在小鼠發育的某個時期或某個組織內做基因剔除，不僅可減少胚胎時死亡機率，也可特定地研究此基因在某發育時期或某組織內之重要性
      - Cre-loxP系統
        
        Cre是P1噬菌體的重組酶(recombinase)，loxP是一組含有34個特定核苷酸之序列，且具有方向性，Cre可以特定地認得loxP序列
        
        若兩個loxP同方向，Cre會把兩個loxP中間之序列刪除，留下一個loxP
        
        若兩個loxP反方向，Cre會把兩個loxP中間之序列做倒轉
        
        應用到基因剔除小鼠
        
        首先，要有一個由特定啟動子控制之Cre重組酶的基因轉殖小鼠，此特定啟動子是依需要而定，我們可選擇只在某特定發育時期或某組織表現之啟動子
        
        此外，還需重新設計標的載體，為了篩選正確之ES細胞，標的載體必須含有正向及負向篩選標記，其中只有正向會留在標的基因內，為了不使正向篩選標記影響基因表現，可將它放在內子/插入序列(intron)內，然後再將兩個同方向之loxP放在標的基因之重要外子/表現序列(exon)的兩旁，以此標的載體利用上述基因標的法產生之小鼠，稱為loxP小鼠
        
        當已各別產生Cre轉殖鼠和loxP小鼠後，再使其互相交配產生同時含有Cre及loxP的小鼠
        
        在此小鼠上，Cre在特定啟動子的控制下，表現出Cre重組酶後便會將兩個loxP中間之序列剔除，如此，就可得到條件性基因剔除小鼠
      - Flp-FRT系統
        
        除Cre-loxP系統外，另一相同原理之系統，從酵母菌而來
      - 除了上述可在特定發育時期或特定組織做基因剔除外，條件性基因剔除也可應用在其他方面
        
        例如利用受特定藥物或荷爾蒙控制表現之啟動子來表現Cre，如此以藥物或荷爾蒙來餵食或施打小鼠，便可在研究者需要的時間或情況下來剔除基因
  - - - 正向篩選標記（使用抗藥性基因）ＮＥＯ
      - 負向篩選標記（胸咁激脢）ＴＫ（白喉毒素）ＤＴ
    - - Ｇ418來篩選帶有neo的細胞
        
        ＥＳ細胞同時帶有neo ＴＫＤＤＴ標記
      - 同時使用正負向標記
        
        篩選出同源組之ＥＳ細胞
        
        稱基因標的法
    - - 方法：用南方末點實驗進一步篩選
      - 原理：在設計標的載體時同時設計限制沒切割位置，限制酶切割ES細胞的基因體DNA，產生不同的長度
    - - 原理：ES細胞(灰色)會和野生型的細胞(黑色)混合，發育成嵌合體
      - 結果：已非黑色毛色的比例來判斷ES細胞發育成生殖細胞的比例
      - 方法：用顯微注射將ES細胞
- - - - 以下就介紹目前製作基因突變的方法及未來可能研發出的新技術
        
        一、ENU (n-ethyl-n-nitrosourea)
        
        這是一種很有效率的突變劑，可以對DNA產生破壞，在基因體上會造成隨機的點突變，因此將ENU打入小鼠之生殖器官，可引發其生殖細胞產生基因突變，藉此可產生大量不同的突變鼠，然後再依突變表現型(phenotype)進行分類與篩選，即可研究不同突變之成因。
        
        此單位主要進行製造突變鼠、建立快速疾病表現型的篩選方法，藉此幫助各個研究單位找出人類疾病的相關基因、建立疾病之動物模式，以開發出與疾病相關之預防和治療方法，並藉此帶動臺灣基因科技醫藥產業。
        
        二、DNA跳躍子(Transposon)
        
        在生物體中存在有多種小型的DNA跳躍子，可以插入基因體中的任何位置
        
        其最早是在玉米中發現的，它可以造成隨機的紫色玉米粒，每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶(transposase)對跳躍子兩端的跳躍元素(transposable element)作用，讓它在特別的序列中跳進跳出。
        
        利用跳躍子的這種特性，不但可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞，只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題，比起化學或物理性的破壞更容易定出位置；而跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選。
        
        這種技術在果蠅等實驗動物中均行之有年，在哺乳類動物中卻十分困難，雖然哺乳類基因體中有各種跳躍子，約佔基因體的40%區域，但在5千萬年前即不再跳動了，近幾年才有適合的跳躍子成功地在人類細胞及小鼠的基因體中跳躍，這些跳躍子最大的特色是沒有特定的宿主，異於以往對跳躍子的認知。
        
        睡美人跳躍子（sleeping beauty，簡稱SB）
        
        這是原本在鮭魚基因體中的跳躍子，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般。
        
        在1997年，科學家們將其改造，如同甦醒的睡美人，可以在人類細胞株基因體中再跳躍。2005年，科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選，當基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後，後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置，SB的插入位置是TA序列。
        
        由於小鼠體內原本沒有這種跳躍子，因此很容易就找出位置，當跳躍酶不存在的狀況下，SB即不再跳躍。
        
        但目前而言，它的跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變，目前有改良的跳躍酶(SB11)基因，可產生更大量的跳躍酶，配合更多的連續SB (T2/onc2)，而在基因體中可以跳得更多更廣。
        
        PB跳躍子（PiggyBac，簡稱PB）：
        
        是原本在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA，在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入，而且沒有特定的區域，只需要是TTAA序列；相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍，2005年，中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統，成為小鼠突變株篩選的另一個更有潛力的新工具。
        
        除此之外，這些非病毒攜帶的跳躍子不會引起病毒插入基因體所造成的種種影響，可能有機會取代病毒載體成為基因治療的新一代載體。