Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
RT-PCR em tempo real Fourplex, Grupo: Gabriel Coutinho (Líder), João…
RT-PCR em tempo real Fourplex
Aplicações biotecnológicas
RT-PCR + eletroforese em gel
RT-PCR em tempo real (TaqMan)
Objetivo
Utilizando o método Fourplex para detecção de um sorotipo viral único, servindo como um fator distintivo, quando comparado ao PCR normal, tornando animador o reconhecimento de infecções causadas por vírus DEN e mostrando como sua especificidade pode ser mais benéfica
Como foi determinado no estudo elaborado, o vírus da dengue possui subdivisões em seus aspectos sorológicos, pois são distintos entre si.
Para que se tenha o objetivo do estudo, faz-se necessário que ocorra a detecção do RNA viral, através do ensaio de amplificação quantitativa, em tempo real, do ácido nucléico.
Essa ferramenta genética de detecção de ácido nucléico, pode ser utilizada como uma forma de determinação de um agente viral, com a sorotipagem.
Metodologia
Para realizar esse experimento, foram utilizados diferentes métodos e materiais, como:
Cepa de vírus
36 cepas contendo os 4 tipos de vírus DEN diferentes
Amostras clínicas humanas para que a aplicação biotecnológica encontre o vírus
Título viral
Dez vezes diluições de vírus protótipo foram feitas para cada sorotipo de vírus DEN em 1 ml de diluente BA-1
Ensaio RT-PCR aninhado
Aquisição de primers específicos para cada sorotipo de DEN
Cinco microlitros de RNA em um volume de reação de 50 μl com a utilização do kit QIAGEN OneStep RT-PCR (com presença de nucleotídeos, MgCl2, primers...)
A desnaturação inicial de 3 min a 94 ° C seguida de 25 ciclos
Cada ciclo continha: Desnaturação a 94 ° C durante 0,5 min, Anelamento a 50 ° C durante 1 min e Extensão a 72 ° C durante 1 min seguido de outra extensão final de 72 ° C por 10 min
ResultadoS do RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% (SeaQem) contendo brometo de etídio
Ensaio RT-PCR (TaqMan) em tempo real
Cada uma das diferentes sondas presentes no vírus, foi marcada com um corante distinto
Em misturas de reação singlepex, continha um único par de iniciadores de cada sorotipo DEN e sonda específicos
As quatro misturas de cada reação foram combinadas em uma mistura de reação total de volume de 50 μl (fourplex)
A transcrição reversa de 10 min a 50 ° C foi seguida por 45 ciclos de amplificação em um Icycler iQ Real-Time Detection System
Primers de vírus DEN específicos de sorotipo e sondas fluorogênicas foram projetados usando os pacotes de software PrimerExpress, para avaliar a especificidade do sorotipo das sequências de primers
Extração de RNA
Extração de 100 μl de isolados de vírus e amostras de soro usando o kit QIAamp Viral RNA Mini
Resultados
Foi constatado que o RT-PCR aninhado foi 10 vezes mais sensível do que o RT-PCR singleplex e fourplex em tempo real
Nos ensaios singleplex e fourplex foram específicos para o serótipo alvo do vírus DEN
Cada iniciador DEN e conjunto de sondas específicos detectou um único alvo de serótipos de vírus DEN para o qual foram projetados
Em todos os 40 casos de infecções por vírus DEN analisados, o RNA viral foi detectado e o serótipo correto foi identificado, tanto no RT-PCR em tempo real quanto no RT-PCR aninhado
Apesar de outros flavivírus estarem relacionados e arboviroses que podem compartilhar a mesma faixa geográfica ou vetor de mosquitos, o ensaio mostrou-se específico do sorotipo do vírus DEN, e todos os genótipos isolados de variantes dentro de um serótipo que foram testados também foram detectados
Grupo: Gabriel Coutinho (Líder), João Victor e Leonardo Bastos