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REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE [PCR] - Coggle Diagram
REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE [PCR]
baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo
Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as
moléculas de DNA em duas fitas simples,
permitindo então a ligação de oligonucleotídeos iniciadores(primers), também em fitas simples e geralmente
constituídos por 15 a 30 nucleotídeos, obtidos por síntese química.
Para realizar PCR são necessárias:
pequenas quantidades do DNA alvo,
um tampão salino contendo a polimerase
os quatro desoxinucleotídeos constituintes do DNA e o cofator Mg2+
oligonucleotídeos iniciadores
Esta mistura
é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:
Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas fitas
Associação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em
fita simples. Para permitir essa associação, a mistura de reação é
arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65 ºC, durante 1
minuto; a temperatura a usar depende da % GC da seqüência a
amplificar)
Extensão dos iniciadores através da síntese da fita complementar de
cada fita molde, catalisada pela DNA polimerase(tipicamente 1
minuto a 72 ºC)
O processo envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes
(25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a
concentração de DNA pré-existente
TUBERCULOSE
Por utilizar “primers” que são específicos para micobactérias do complexo
tuberculosis, a PCR é capaz de, em poucas horas, definir sobre a presença ou
não do patógeno na amostra e indicar a melhor terapêutica para o caso
Em condições extremas, esta técnica pode ser refinada para torná-la capaz de
determinar não só a presença, mas também a sensibilidade de micobactérias
aos tuberculostáticos disponíveis para o tratamento da tuberculose.
Para a detecção do M. tuberculosis a cultura pode ser considerada
o “gold standard”, por ter especificidade de 100% e sensibilidade de
aproximadamente 90%2.
O presente resultado mostrou
um teste capaz de detectar até 3 bacilos em uma solução-padrão, o que confirma a extrema sensibilidade da técnica em amplificar
seqüências genômicas do M. tuberculosis.
Para que a cultura de um espécime clínico seja
positiva são necessárias entre 10 e 100 células de M. tuberculosis na amostra
A PCR é capaz de detectar até uma cópia de DNA de M. tuberculosis, como
já foi demonstrado por Eisenach et al (1990).