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第8章 - Coggle Diagram

- - - - 原本在鮭魚基因中的跳躍子，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般。
- - - - 如果以懷孕母馬血清性腺激素（pregnant mare’s serum gonadotropin，簡稱PMSG）和人類絨毛膜性腺激素（human chorionic gonadotropine，簡稱hCG）來代替FSH和LH之功能，施打於4~6週之母鼠，可促使其大量排卵，每次約可排出20~30個卵，因為基因轉殖和基因剔除技術皆需要利用到很多的受精卵及胚胎，因此使母鼠大量排卵的方法可減輕收集受精卵和胚胎的工作量
        
        此外，基因轉殖和基因剔除技術也需要用到假懷孕之母鼠，假懷孕之母鼠是指正常母鼠和不孕公鼠交配後，其子宮會變化成適合使受精卵著床的狀況，但因公鼠不孕，故母鼠之卵子無法受精，此母鼠即為假懷孕
- - - - 正向篩選標記
        
        放在兩段同源序列中間
        
        使用抗藥性基因，常用為抗新黴素基因(neo)
      - 負向篩選標記
        
        胸苷機酶(TK)
        
        使gancyclovir磷酸化
        
        白喉毒素
        
        抑制真核細胞蛋白質合成
      - 和ES細胞同源的兩段標的基因序列
    - - 基因標的法
        
        利用正向和負向篩選標記，便可篩選出有同源重組之ES細胞。
      - 基因剔除
        
        以上方法，造成基因功能破壞之改變
    - - ES細胞培養
      - 基因同源重組
        
        兩段相似或是一致的DNA，就能產生
    - - 南方墨點實驗進一步確認有無，利用限制酶切不同長度，來分辨同源重組之es細胞
- - - - 為了篩選帶有標的載體之ES細胞，我們可以G418來篩選帶有neo的ES細胞。同時利用正向和負向篩選標記，便可篩選出有同源重組之ES細胞。這種改變特定染色體基因的方法，就叫做基因標的法，如果是造成基因功能破壞之改變，就叫做基因剔除。
    - - 以南方墨點實驗進一步篩選，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。此外，PCR也可用來篩選有同源重組之ES細胞，其引子之設計是一個位於neo內，另一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上，如此才可分辨出是非同源重組之ES細胞或是同源重組。
    - - 正向篩選標記:一般都是使用抗藥性基因，常用的標記為抗新黴素基因，此方法是要篩選帶有neo和ES細胞。
      - 負向篩選標記:常用標記有胸苷激酶(TK)，會表現TK的細胞無法存活在含有gancyclovir的培養液中，還有白喉毒素(DT)，抑制真核細胞的蛋白質合成，若細胞會表現DT，就會殺死自己。
      - 和ES細胞同源的兩段標的基因序列
    - - 得到基因剔除之ES細胞後，將此ES細胞以顯微注射打入囊胚，再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內，ES細胞會和野生型之囊胚細胞混合，發育生長成一個混合之個體，稱為嵌合體。經由和ES細胞同樣的篩選方法來篩選嵌合小鼠之後代，得到單套基因剔除小鼠後，再使其互相交配，即可有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠。
- - - - 基轉小鼠製作流程
        
        產生基因轉殖小鼠
        
        以基因選殖得到轉殖基因株，再將轉殖DNA片段分離出來
        
        篩選基因轉殖小鼠
        
        取小鼠基因體製成能夠篩選之基因體DNA
        
        以PCR篩選
        
        南方墨點法偵測基轉基因
        
        設計基轉基因
        
        啟動子
        
        控制基因表現
        
        編碼區域
        
        產生蛋白質
      - 基轉基因之表現
        
        轉殖基因插入位置
        
        轉殖基因套數
      - 應用
        
        研究啟動子區域
        
        研究基因產物
        
        定點突變