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PCR, Teste diagnóstico para COVID 19 - Coggle Diagram
PCR
Aplicação da técnica da PCR
Diagnóstico molecular
Identificação de espécies
Genética Forense
Teste de paternidade
Análise de expressão gênica
Clonagem
Filogenia molecular
Detecção de mutações
Polymerase Chain Reaction
Desenvolvida por Kary Mullis e publicada em 1985 na revista Science
Kary Mullis ganha o Nobel de química em 1993 devido a descoberta dessa técnica
Permite a amplificação de um fragmento específico de DNA
Componentes
DNA molde
DNA que será amplificado pela reação
DNA Polimerase
Enzima responsável pela polimerização do DNA
Em 1986 a enzima polimerase da
Termus aquaticus
foi isolada e passou a ser utilizada nas reações de PCR por aguentar altas temperaturas
Nucleotídeos
Os DNTPs que serão adicionados à fita de DNA
Primers
Os iniciadores da polimerização que fornecem a extremidade OH livre para que a polimerase exerça sua função
Desenhados pelo pesquisador delimitando a área que será amplificada
Cloreto de Magnésio
Cofator da polimerase
Tampão
Mantém o ambiente químico favorável para que a polimerase trabalhe
Reação
A reação ocorre se utilizando da oscilação de temperatura para permitir a abertura das fitas, anelamento dos iniciadores e polimerização
Temperatura inicial
Desnaturação
95°C
Temperatura onde a fita dupla do DNA molde tem suas pontes de Hidrogênio desnaturadas formando duas fitas simples
Anelamento
50-65°C
Temperatura ótima em que os primers se ligam por complementariedade as fitas de DNA molde
Calculada por: Ta=Tm-2
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Extensão
72°C
Polimerização das duas fitas simples de DNA realizada pela polimerase
Reação e análise do resltado
Após a adição dos componentes no eppendorf, seguimos para o termociclador
É no termociclador que ocorre a reação de PCR.
Após o final do ciclos da PCR precisamos analisar o resultado obtido na reação.
O resultado é analisado através da técnica de eletroforese
A eletroforese é uma técnica que consiste na separação de moléculas através do seu peso molecular, devido ao campo elétrico que gera uma diferença de potencial e atraí as moléculas de acordo com sua carga.
Para visualizar a eletroforese levamos a cuba para um equipamento que emite luz ultravioleta ou LED, chamado de transiluminador .
Visualização
São utilizados uma matriz ou géis , que podem ser de agarose ou poliacrilamida, que fornecem condições ideais para que as moléculas possam migrar para o polo que lhe atrai.
Termociclador é um equipamento responsável por oferecer as condições adequadas para cada etapa da PCR. O equipamento é ajustado para quantidades de ciclos que a reação deve ocorrer, além de oferecer a temperatura ideal para cada etapa da PCR.
Teste diagnóstico para COVID 19
Detecção do vírus
através do RT-PCR
Coleta de secreção biológica por meio de swab
O RNA será isolado e será adicionado a uma solução contendo enzima RT, nucleotídeos, primers, tampão, nucleotídeos e DNA polimerase e será submetido as etapas da PCR
O diferencial é que a enzima Transcriptase reversa vai utilizar o RNA como molde para produzir DNA complementar (cDNA)!
A amostra vai ser amplificada
A análise vai permitir detectar o RNA viral, se este estiver presente, o teste para o COVID será positivo! Essa observação pode ser feita por PCR em tempo real
O ideal é que o RT-PCR seja realizado na primeira semana de infecção, no qual o vírus está presente em grande quantidade, assim fica de fácil identificação!
E evita o diagnóstico Falso negativo ou falso positivo!
