Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

CH8 基因轉殖與基因剔除技術, 10941001a, 10941019A, 10941001a - Coggle Diagram

- - - - 可研究調控因子對基因表現之重要性
    - - 可研究蛋白質之突變對其功能有何影響
  - - - 只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題
      - 跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選
    - - 原本在鮭魚基因體，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了
        
        1997年，科學家們將其改造，可以在人類細胞株基因體中再跳躍。
        
        2005年，科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選
    - - 原本在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA，在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入
        
        2005年，中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統
  - - - 對DNA產生破壞，在基因體上會造成隨機的點突變
        
        以整合型計畫實行
- - - - 標的載體3要素
        
        1.和ES細胞同源的兩段標的基因序列
        
        2.一個放在兩段同源序列中間的正向篩選標記
        
        使用抗藥性基因，常用為抗新黴素基因
        
        方式:是在培養ES細胞的培養液內加入G418藥劑，抑制蛋白質合成，致細胞死亡，而neo基因之產物可將G418代謝成無毒形式，因此帶有neo之細胞可活在G418培養液中
        
        目的:篩選帶有neo的ES細胞，所以neo叫做正向篩選標記
        
        3.一個放在兩段同源序列外的負向篩選標記
        
        常用標記有胸苷激酶(TK)、白喉毒素(DT)
        
        原理:
        TK標記:若培養液中含有核酸類似物gancyclovir，TK蛋白會將gancyclovir磷酸化，細胞的DNA聚合酶使用這種怪怪核苷，DNA合成會中斷，培養液中就不會出現有TK的細胞
        DT標記:是一種蛋白毒素，會抑制真核細胞的蛋白質合成，若細胞表現DT，會殺死自己
        
        目的:篩選不帶有TK or DT 的ES細胞
    - - 構築好標的載體後，一般是以效率較高之電穿孔方式將載體送入ES細胞
      - 可以用G418來篩選帶有neo的ES細胞
      - 送入ES細胞之DNA大部分是以隨機的方式插入染色體，就會產生不要的ES細胞，同時帶有neo和TK or DT
      - 同時使用正向和負向篩選標記，就可以篩選出有同源重組之ES細胞，此改變特定染色體基因的方法，稱為基因標的法；造成基因功能破壞之改變，稱為基因剔除
    - - 設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
    - - ES細胞和囊胚混合後可產生嵌合小鼠，因ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因，囊胚帶有黑色毛色基因，如果ES細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞，嵌合小鼠和野生型黑毛小鼠交配，會生出非黑毛之小鼠；若囊胚細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞，則會生出黑毛小鼠，以此毛色篩選方法可方便地篩選掉大部分非基因剔除小鼠。
  - - - 在設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞
    - - 其引子之設計是一個位於neo內，另一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上，如此才可分辨出是非同源重組之ES細胞（做不出PCR產物），或是同源重組（可做出PCR產物）
  - - - 在特定發育時期或特定組織基因剔除
        
        Cre-loxP系統
        
        Cre:噬菌體的重組酶
        
        loxP:含有34格特定格特定核甘酸序列
        
        兩個同向oxP:Cre將兩lop中間序列刪除留下一個loxP
        
        兩個反向loxP:Cre
        
        範例
        
        分別產生Cre轉殖鼠和loxP小鼠互相交配，產生子代
        
        Cre在特定啟動子的控制下，將兩個loxP中間序列剔除
        
        得到條件性基因剔除小鼠
        
        1 more item...
        
        loxP:兩個loxP必須標記在exon兩旁
        
        相同原理系統:Flp-FRT(酵母菌而來)
- - - - 懷孕母馬血清性腺激素PMSG + 人類絨毛膜性腺激素hCG
      - 可排出20～30個卵／次
    - - 方法
        
        正常母鼠＋不孕公鼠
      - 結果
        
        使子宮適合受精卵著床
        但是公鼠不孕，卵子無法受精
  - - - 胚胎之細胞分化
        
        內層：內細胞質團（ICM）
        
        多元分化
        
        分化成胚胎的各個構造（ex:E5細胞）
        
        細胞形狀較平，細胞間接觸緊密
        
        細胞膜／細胞質發育成不同特性
        
        此時的胚胎成稱為“胚囊”
        
        胚胎中間形成一個空腔
        
        外層：滋養外胚層
    - - 分裂期
        
        受精卵分裂：一個細胞分裂為多個細胞
        
        胚胎大小不變，但胚胎中的細胞數目變多
    - - 子宮內膜著床
        
        原腸胚形成
        胚胎快速發育生長
    - - 半夜12:00pm交配，交配後第一天中午的受精卵
    - - 完整個體形成
- - - - 方法
        
        顯微注射
      - 目的
        
        得到基因轉殖小鼠
        
        如何得到？
        
        打入受精卵的轉殖基因DNA隨機插入染色體的任何一個位置，
        並隨著染色體複製而遺傳至小鼠體內的每一個細胞
      - 過程
        
        將轉殖基因DNA片段從質體分離純化，
        以“顯微注射”把轉殖基因DNA打入單細胞之受精卵，
        再將此受精卵送入假懷孕母鼠子宮，19～20天後即可生出小鼠。
    - - 方法
        
        PCR技術
        
        設計一組可特異地增幅出屬於轉殖基因部分序列的引子
        
        南方墨點實驗
        
        以轉殖基因當作探針，
        即可在轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段。
        
        優點
        
        可計算有多少“套數（copy number）”的轉殖基因
        
        缺點
        
        轉殖基因的套數太多，會抑制轉殖基因的表現
      - 必要條件
        
        取得小鼠之"基因體DNA"
        
        如何取得？
        
        剪一小段約0.5公分的小鼠尾巴，並純化出能夠篩選基因體DNA的量
    - - 啟動子
        
        控制基因表現
      - 編碼區域
        
        轉錄＆轉譯產生基因產物－蛋白質