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基因轉殖及基因剔除技術 - Coggle Diagram

- - - - 它的跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變
    - - 在菜蛾基因體中
    - - 當基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後，後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置
  - - - 相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍
    - - ENU
        
        (優)很有效率的突變劑
        (缺)需要用到的資源及人力非常龐大
      - 跳躍子
        
        (優)容易定岀基因位子、可行大規模的篩選
        (缺)難利用在哺乳動物中
    - - 運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統
  - - - 單細胞之受精卵
    - - 轉殖基因插入染色體之位置
      - 2.轉殖基因套數
    - - 利用懷孕母馬血清激素及人類絨毛膜性腺激素
  - - - 正向篩選標記(positive selection marker)
      - 和ES細胞同源的兩段標的基因序列
      - 負向篩選標記(negative selection marker)
    - - 从受精四天后的早期小鼠
    - - 將生物體身上每一個細胞的某個特定基因破壞掉
      - 同源重組
  - - - PCR或是南方墨點實驗
    - - Cre是P1噬菌體的重組酶，loxP是一組含有34個特定核苷酸的序列，且具方向性，Cre可以特定的認得loxP序列。若有兩個loxP是同方向，Cre會把兩個loxP中間的序列刪除，留下一個loxP；若兩個loxO是反方向，Cre會把兩個loxP中間的序列倒轉
    - - 得到基因剔除之ES細胞後，將此ES細胞以顯微注射打入囊胚(blastocyst)，再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內，ES細胞（灰色）會和野生型之囊胚細胞（黑色）混合，發育生長成一個混合之個體
  - - - 每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶對跳躍子兩端的跳躍元素作用，讓它在特別的序列中跳進跳出。
    - - 在鮭魚基因體中
      - 在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般
      - 插入位置是TA序列
    - - 利用受特定藥物或荷爾蒙控制表現的啟動子來表現Cre，便可在研究者需要的時間或情況下來剔除基因
- - - - 早期胚胎發育緩慢
    - - 分裂期，受精卵由一個細胞分裂為多個細胞
    - - 胚胎之細胞開始分化
    - - 胚胎著床至子宮內膜
    - - 發育成一完整個體
- - - - 在某基因之編碼區域內加上外來基因之編碼序列，使外來基因之表現可受此基因之啟動子所調控
    - - 區域
        
        啟動子區域
        
        研究調控因子對基因表現之重要性
        
        編碼區域
        
        研究蛋白質之突變對其功能有何影響
      - 原理
        
        利用基因標的法將內員機作點突變
  - - - 在生物體中存在有多種小型的DNA跳躍子，可以插入基因體中的任何位置
      - 其最早是在玉米中發現的，它可以造成隨機的紫色玉米粒，每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶對跳躍子兩端的跳躍元素作用，讓它在特別的序列中跳進跳出
      - 利用跳躍子的這種特性，不但可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞，只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題，比起化學或物理性的破壞更容易定出位置
      - 而跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選
      - 這種技術在果蠅等實驗動物中均行之有年，在哺乳類動物中卻十分困難，雖然哺乳類基因體中有各種跳躍子，約佔基因體的40%區域，但在5千萬年前即不再跳動了
      - 近幾年才有適合的跳躍子成功地在人類細胞及小鼠的基因體中跳躍
      - 這些跳躍子最大的特色是沒有特定的宿主，異於以往對跳躍子的認知
    - - 這是原本在鮭魚基因體中的跳躍子，在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了，像沉睡了一般。
      - 1997年
        
        在人類細胞株基因體中再跳躍
      - 2005年
        
        SB的插入位置是TA序列
        
        基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後，後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置
        
        科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選
      - 小鼠體內原本沒有這種跳躍子
        
        很容易就找出位置
        
        跳躍酶不存在的狀況下
        
        SB即不再跳躍
      - 跳躍頻率仍不太高
        
        不足以進行大規模的篩選突變
        
        改良跳躍酶(SB11)基因
        
        可產生更大量的跳躍酶
        
        配合更多的連續SB (T2/onc2)
        
        在基因體中可以跳得更多更廣
      - 所跳躍的範圍仍靠近原本的位置，這些都可能在逐一研究之後慢慢改良。
    - - 在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA
      - 在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入，而且沒有特定的區域，只需要是TTAA序列
      - 相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍
      - 2005年
        
        中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統，成為小鼠突變株篩選的另一個更有潛力的新工具
      - 非病毒攜帶的跳躍子不會引起病毒插入基因體所造成的種種影響
      - 可能有機會取代病毒載體成為基因治療的新一代載體
  - - - 4.生殖細胞產生基因突變
      - 5.產大量不同的突變鼠
      - 3.將ENA打入小鼠之生殖器官
      - 6.依突變表現型行分類與篩選
      - 2.在基因體上造成隨機的點突變
      - 7.研究不同突變之成因
      - 1.破壞DNA
    - - 1.製造突變鼠
      - 2.建立快速疾病表現型的篩選方式
      - 3.找出人類疾病的相關基因
      - 4.建立疾病之動物模式
      - 5.民國90年由中研院成立
- - - - 轉殖基因的套數太多，會抑制轉殖基因的表現
    - - 轉殖基因插入之位置附近有靜默子或加強子，促進或抑制轉殖基因的表現
  - - - 選用只在肝組織表現之啟動子，如此便可研究此基因在肝組織表現會有何影響
    - - 突變對基因之產物的功能有何影響
      - 突變之產物對實驗動物會造成何種生理之改變
    - - 便可以報告者基因之表現量多寡來代表待研究之啟動子之強弱
  - - - 2.把轉殖基因DNA片段從質體分離純化出來
      - 3.以顯微注射之方式把轉殖基因DNA打入單細胞受精卵
      - 1.已經因選殖的方式得到我們要的基因株
      - 4.將此受精卵送回至假懷孕之母鼠子宮內，19~20天之後即可生出小鼠
    - - 利用PCR技術，設計出一組轉殖基因部分序列的引子
      - 也可用南方墨點實驗來偵測轉殖基因
      - 剪一小段約0.5公分的小鼠尾巴，純化出能夠篩選的基因體DNA
      - 以轉殖基因當作探針，可在轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段，計算出有多少套數的轉殖基因。
      - 取得小鼠基因體DNA
    - - 可使基因表現的條件
        
        啟動子
        
        控制基因之表現
        
        編碼區域
        
        可經由轉錄及轉譯過程而產生基因產物—蛋白質
- - - - 以電穿孔(electroporation)將標的載體送入ES細胞中
      - 以G418來篩選帶有neo的ES細胞。
        送入ES細胞之DNA大部分是以隨機的方法插入染色體內，此ES細胞就會同時帶有neo和TK或DT標記，但G418藥劑不會殺死這些細胞
      - 基因標的法(gene targeting)
        
        同時利用正向和負向篩選標記（同時在培養液中加入G418和gancyclovir，若是使用DT，只加G418即可），便可篩選出有同源重組之ES細胞
    - - 介紹
        
        1.正向和負向篩選標記可以幫助挑出發生同源重組之ES細胞,但效果不是百分之百
        
        2.需再以南方墨點實驗進一步篩選確認有同源重組之ES細胞
      - 做法
        
        1.設計標的載體時要同時設計限制酶切割位置
        
        2.篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞
      - 圖示
    - - 和ES細胞同源的兩段標的基因序列
      - 正向篩選標記(positive selection marker)
        
        使用抗藥性基因 : 抗新黴素基因（Neomycin-resistance，簡稱neo）
        
        篩選方式
        
        在培養ES細胞的培養液內加入G418藥劑，G418會抑制蛋白質的合成，造成細胞死亡，neo基因之產物可將G418代謝成無毒之形式，因此帶有neo之細胞即可存活在含有G418的培養液中。篩選帶有neo的ES細胞
        
        放在兩段同源序列中間
      - 負向篩選標記(negative selection marker)
        
        常用的標記
        
        白喉毒素（diphtheria toxin，簡稱DT）
        
        是一種蛋白毒素，會抑制真核細胞的蛋白質合成，若細胞會表現DT，就會殺死自己。
        
        胸苷激酶（thymidine kinase，簡稱TK）
        
        若培養液內含有核酸類似物gancyclovir，TK蛋白會將gancyclovir磷酸化，細胞的DNA聚合酶若使用這種不正常之核苷，會使DNA合成中斷，因此TK的細胞無法存活在含有gancyclovir的培養液中
        
        目的
        
        要篩選不帶有TK或DT的ES細胞
        
        放在兩段同源序列外
    - - 圖示
      - 介紹
        
        嵌合體(chimera)
        
        得到基因剔除之ES細胞後，將此ES細胞以顯微注射打入囊胚(blastocyst)，再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內，ES細胞（灰色）會和野生型之囊胚細胞（黑色）混合，發育生長成一個混合之個體
  - - - 只在小鼠發育的某個時期，或只在小鼠的某個組織內做基因剔除，不僅可以減少胚胎時期小鼠死亡的機率，也可以特定地研究此基因在某發育時期或組織的重要性
      - 需要利用到Cre-locP
        
        Cre是P1噬菌體的重組酶，loxP是一組含有34個特定核苷酸的序列，且具方向性
        
        Cre可以特定的認得loxP序列
        
        若有兩個loxP是同方向，Cre會把兩個loxP中間的序列刪除，留下一個loxP
        
        若兩個loxO是反方向，Cre會把兩個loxP中間的序列倒轉
      - Flp-FRT
        
        與Cre-loxP有相同原理
        
        是從酵母菌來的
      - 主要以Cre-loxP系統來解釋如何應用到基因剔除小鼠上
        
        要有一個由特定啟動子控制的Cre重組酶的基因轉殖小鼠
        
        可選擇只在特定發育時期或只在特定組織表現的啟動子
        
        需要重新設計標的載體，必須含有正向及負向篩選標記
        
        只有正向篩選標記會留在標的基因內，為了不使正向標記影響基因表現，可將正向篩選標記放在內子/插入序列內，以減少對基因表現的影響
        
        將兩個方向的loxP放在標的基因的重要外子/表現序列的兩旁
        
        利用上述基因標的法產生的小鼠，稱為loxP小鼠
      - 當個別產生Cre轉殖鼠和loxP小鼠後，再使其互相交配產生同時有Cre和loxP的小鼠
        
        此小鼠身上，Cre在特定啟動子的控制下，表現在特定的時間或組織後便會將兩個loxP中間的基因序列剔除
        
        得到特定發育時期或特定組織的基因剔除小鼠
      - 其他應用
        
        利用受特定藥物或荷爾蒙控制表現的啟動子來表現Cre，便可在研究者需要的時間或情況下來剔除基因