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聚合酶連鎖反應 - Coggle Diagram
聚合酶連鎖反應
問題與討論
1.請簡述PCR的三個步驟及原理。
步驟
引子黏合
降溫至55度左右，使引子可與序列互補的單股DNA特異性黏合
延展
DNA聚合酶接著引子3'端行聚合反應，合成與魔半DNA互補的序列，形成新的雙股DNA
變性
以95度加熱將模板雙股DNA分開
原理
需行25~30個循環
以等比級數增加標的片段的數量
5.試述每次PCR反應都要做何種對照組以分辨偽結果之產生？
PCR反應可能會以少量的DNA污染作為模板，產生出我們不要的PCR產物
4.請試述一個好的PCR引子有哪幾個條件？
一條引子內不可出現會在引子內部產生互補的3個以上連續之鹼基，這種序列會在引子內形成分子內二級結構，影響引子和模板黏合的效率。
長度為18~25個鹼基，兩條引子的長度不可相差大於3個鹼基數
G/C的比例=(G+C)/(A+T)的值大約是40~60%，四種鹼基的分佈要平均
兩條引子的解鏈溫度（melting temperature，簡稱Tm）要相近，不可相差5℃以上
引子3'端之序列不可和其他的引子互補，一旦有分子間配對，會產生引子二聚物(primer dimer)
3.一個PCR反應需加入哪幾項試劑？
三磷酸去氧核苷酸（Deoxyribonucleotide Triphosphates，簡稱dNTPs）
MgCl2
PCR引子
模板DNA (Template DNA)
熱穩定DNA聚合酶(Thermostable DNA Polymerase)
6.除了本章列舉的三個PCR應用，請試著提出任一種可利用到PCR技術之應用。
食品原料鑑定
Real-time PCR
7.試述RT-PCR中RT的原理。
以反轉錄酶從RNA製造其互補DNA
8.為何同步PCR可在做PCR的同時偵測出PCR之產物？
因機器在每個PCR循環皆可測到螢光，以循環數目對螢光直可畫出曲線圖，在同樣的螢光值下，若模板的量越少，對應出之循環次數就越多
9.同步PCR中螢光是如何標記至PCR產物？
雜交探針
水解探針
DNA結合染劑SYBR green1
2.PCR所使用之聚合酶的最重要特性為何？並請試述為何重要。
耐高溫
Ta有助於提高引物專一性、減少非特異性產物
10.醫學鑑定主要是以PCR增幅哪兩種DNA？
序列多型性DNA
長度多型性DNA
7-2 PCR的基本條件(10941062A)
熱穩定DNA聚合酶(Thermostable DNA Polymerase)
Taq
從嗜熱性細菌Thermus aquaticus所分離出來
缺點
合成之DNA片段的長度有限
不具有校正(proofreading)之功能，錯誤率約為1.3×10–5，每合成105個核苷即會出現一個錯誤，稱之為忠實度(fidelity)不高
目前最常用之熱穩定DNA聚合酶
PCR引子
以人工合成的寡聚核苷酸(oligonucleotide)，每一條的使用濃度為0.1~0.5 μM之間，足夠進行30個循環的PCR反應。
決定PCR能不能成功最重要的因素
有設計引子之軟體應用程式可利用，然而PCR的反應不一定可以成功
條件
引子3'端之序列不可和其他的引子互補，一旦有分子間配對，會產生引子二聚物(primer dimer)
引子二聚物：引子互相黏合，互為模板而進行聚合反應之產物，會消耗可和模板黏合的引子、聚合酶及dNTPs等，減少標的DNA之增幅效率
一條引子內不可出現會在引子內部產生互補的3個以上連續之鹼基，這種序列會在引子內形成分子內二級結構，影響引子和模板黏合的效率。
G/C的比例=(G+C)/(A+T)的值大約是40~60%，四種鹼基的分佈要平均
兩條引子的解鏈溫度（melting temperature，簡稱Tm）要相近，不可相差5℃以上
解鏈溫度:
50%的DNA為單股時的溫度，和DNA的長度以及G/C比例有關
計算解鏈溫度的方程式:Tm (℃) = 2(A+T) + 4(G+C)
長度為18~25個鹼基，兩條引子的長度不可相差大於3個鹼基數
三磷酸去氧核苷酸（Deoxyribonucleotide Triphosphates，簡稱dNTPs）
包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，使用濃度是200~250 μM
dNTP是用來作為合成DNA的受質(substrate)，使用濃度是200~250 μM
利用PCR合成帶有標記的DNA，可以在dNTP以一種帶有標記之三磷酸去氧核苷酸取代原本的三磷酸去氧核苷酸
例如以放射性元素32P標記之dCTP取代單純之dCTP，或是DIG標記的dATP
MgCl2濃度
所有的熱穩定DNA聚合酶都需要游離型態的鎂離子(Mg2+)才有活性
PCR反應是使用200 μM的dNTP配1.5 mM的MgCl2，但dNTP、寡聚核苷酸、焦磷酸根(pyrophosphate, PPi)及EDTA都會和鎂離子結合，因此鎂離子濃度對不同的PCR反應不同
熱穩定DNA聚合酶會隨著酵素附加三種試劑:含有1.5 mM MgCl2的緩衝液，一個是不含MgCl2的緩衝液，
MgCl2溶液
模板DNA (Template DNA)
雙股或是單股的DNA
模板DNA越純，PCR反應成功機會越大，不純的DNA也許會含有聚合酶的抑制物，會影響PCR的效率
模板DNA的量會影響PCR的結果，人類基因體DNA需要500 ng的模板DNA，質體DNA需要0.1~1 ng的模板DNA
偽結果(false positive)
以少量的DNA污染作為模板，產生出我們不要的PCR產物
每組PCR實驗都要多做一個負對照組(negative control)，包含所有的PCR試劑:引子、聚合酶、dNTP及緩衝液，但不加模板DNA
成功的PCR反應在負對照組中看不到PCR產物的產生，若有得到任何的PCR產物，代表實驗可能被除了模板之外的DNA所污染，或有引子二聚物之產生
7-3 PCR的應用
(10941023A.10941029A.10941034A.10941039A.10941052A.10941064A)
一. 反轉錄PCR
(10941034A)
如圖7-2，RT-PCR的第一步是以反轉錄酶
從RNA製造其互補DNA
再以cDNA當作模板
股特定之引子做PCR，增幅特定之序列
一般之PCR是以DNA當作模板
在製造cDNA時
可使用寡聚胸苷酸(oligo(dT))引子
特定基因之引子(gene-specific primer)
隨機引子(random primers)
mRNA的3'端帶有一段聚合腺苷酸尾巴
使用oligo(dT)當作引子，可合成所有mRNA的cDNA
使用特定基因引子，只會合成此基因之cDNA
隨機引子是長度為6個鹼基之寡聚核苷酸
隨機引子可黏合至RNA的任一個位置，合成出長度不一之cDNA
cDNA合成效率很差時，就可使用隨機引子來替代其他引子。
二.同步PCR和定量PCR
(10941023A.10941039A)
比較
傳統
耗時費工,同一樣品取樣多次易造成汙染,電泳分析之靈敏度不高
現在
所需時間少,靈敏度高,
可定量
(可以隨時記錄PCR反應之結果)
圖示
作法
傳統
對同一樣品同時做不同循環數之PCR反應
產物再用電泳分離
溴化乙錠(ethidium bromide)染色或是南方墨點實驗(Southern blot)來偵測PCR產物
再將樣品與標準值做比較
現在(同步PCR)
螢光技術加上PCR儀器的應用
同步進行PCR反應和偵測螢光
PCR常用螢光技術
雜交探針(Hybridization probe)
水解探針
DNA結合染劑SYBR Green I
介紹
與DNA結合後會發出更強的螢光所以在PCR過程延展步驟結束後測量的代表DNA螢光強弱
SYBR Green I可和所有的雙股DNA結合，並無法分辨特異性PCR產物和非特異性PCR產物，此時可用解鏈曲線分析來區分出特異性或非特異性的PCR產物
圖示
總結
目前較常使用的是SYBR Green I
定量PCR
介紹
利用同步PCR做定量
模板的量越少循環次數就越多
找出每一種模板濃度螢光值進入log直線區域的那一點這些點都位在同一直線上(交叉直線)
方法
絕對定量
要使用已知濃度之模板做出一條標準曲線，利用此標準曲線可算出樣本的真正濃度
相對定量
目的是要比較不同樣本之間的差異，計算方式之原理和絕對定量一樣
圖示
三.解鏈曲線分析
(10941029A)
解鏈溫度
和DNA長度及G/C比例有關，因此解鏈溫度可以用來分辨產物中不同的DNA片段
當溫度到達解鏈溫度時，雙股DNA分開，螢光值會驟降，但在10套和104套的曲線可看出有兩次的溫度驟降，這代表有兩種PCR產物
解鏈曲線分析
可以應用在使用SYBR Green I以及雜交探針的PCR，但卻不適用於水解探針，因水解探針在PCR過程中已被水解
使用SYBR Green I做完PCR後可以用解鏈曲線分析是否有非特異性產物，如果有，就必須更改PCR反應條件或重新設計引子，以去除非特異性產物的產生
同步PCR
特點
可以在PCR完成後利用解鏈曲線來分析PCR之產物
用途
PCR產物之鑑定及偵測突變。
圖7-9
如圖7-9，以0套、10套和10000套的模板為例，即使是不加模板，若是引子自己即可配對，以SYBR Green I為染色方式還是可以偵測到螢光的增加，這表示SYBR Green I染色無法分辨非特異性產物
在進行完PCR反應後，持續增加溫度並同時記錄螢光值之變化，可得到如圖7-9(b)的曲線圖
因為螢光值對溫度的曲線圖較難看出差異，所以我們可以對曲線做一次微分（代表每單位溫度螢光的變化），相對於溫度重新畫出圖7-9(c)的曲線圖
在這新的圖中，三個不同濃度模板的差異就比較容易分辨，位於左邊的波峰代表引子二聚物，因為長度較短，因而解鏈溫度較低；右邊的波峰溫度較高，代表是標的產物
0套的曲線沒有模板DNA就沒有右邊的波峰，但有左邊引子二聚物的波峰；而模板數量少，能得到的特異性產物相對的也較少，因此10套的曲線其右邊波峰較10000套低
圖7-10
除了可辨別產物特性，解鏈曲線分析還可用來偵測突變，如圖7-10
如果將雜交探針設計成可雜交至突變點的位置，完成PCR反應後，進行解鏈曲線分析，因錯誤配對會降低解鏈溫度，所以從圖7-10(c)可看出右邊波峰代表野生型，左邊波峰代表突變型，在基因型鑑定上可分辨成如果只有右邊波峰代表是同型野生型，如果只有左邊波峰代表同型突變型，而如果兩個波峰都有，就代表異型突變型。
四.鑑定科學
(10941052A.10941064A)
DNA多型性
序列多型性(sequence polymorphism)
基因序列上有少數鹼基差異
長度多型性(length polymorphism)
又稱變異性重複序列(variale number tandem repeat)
重複DNA所造成
這些變異以限制酶切割位置來區分，稱為限制酶片段多型性(restriction fragment-length polymorphism)
利用PCR技術來分析VNTR，稱為增幅長度多型性(amplified fragment-length polymorphism)
VNTR
短重複序列(short tandem repeat，簡稱STR)
由2～7個鹼基對重複排列所組成
一般在基因體內的長度是100～400鹼基對之間
對同一個STR基因座，不同個體的STR長度不同
PCR可以分析非常少量的DNA，而且即使有部分被分解，因STR長度很短，所以PCR技術還是可以增幅且分析STR
STR系統可作為一種鑑識方式
粒線體DNA(mitochondrial DNA簡稱mtDNA)
可作為一種鑑識方式
此法可鑑定兩個個體是否為同一母系
粒線體本身含有單套的遺傳物質，和孟德爾遺傳定律方式不同，稱為母系遺傳(maternal inheritance)
精子只有細胞核會進入卵子內，因此從受精卵發育完成的個體的粒線體是完全遺傳自母親
7-1 PCR的基本原理及作法
(10941012A)
PCR反應
以等比級數增加標的片段的數量
25個循環可產10的6次方倍的模板DNA數量
需行25~30個循環
PCR機器
條件
溫度變化要夠快
溫度之維持必須要穩定
步驟
1.PCR反應所需試劑全放入管子內
2.將管子放入金屬凹槽
3.設定好需要的溫度
4.即可自動控制溫度變化、反應時間
原理
導熱快速的金屬塊
PCR三步驟
引子黏合(primer annealing)
降溫至55度左右，使引子可與序列互補的單股DNA特異性黏合
每種引子黏合所需溫度不同，均需先測出一個信號最強、背景值最低之引子黏合溫度
變性(denaturation)
以95度加熱將模板雙股DNA分開
延展(extension)
DNA聚合酶接著引子3'端行聚合反應，合成與魔半DNA互補的序列，形成新的雙股DNA
DNA聚合酶的延展最佳溫度是72度
