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生技概論 第八章 基因轉殖及基因剔除技術 - Coggle Diagram
生技概論 第八章 基因轉殖及基因剔除技術
8-3 基因剔除(10941028A、10941031A、10941044A)
製造流程
一.設計標的載體
和ES細胞同源的兩段標的基因序列
一個放在兩段同源序列中間的正向篩選標記:一般都是使用抗藥性基因，常用的標記為抗新黴素基因
篩選方式
在培養ES細胞的培養液內加入G418藥劑，G418會抑制蛋白質的合成，造成細胞死亡，而neo基因之產物可將G418代謝成無毒之形式，因此帶有neo之細胞即可存活在含有G418的培養液中
是要篩選帶有neo的ES細胞，故neo叫做正向篩選標記
同源序列外的負向篩選標記
胸苷激酶
白喉毒素
目的
篩選不帶有TK或DT的ES細胞
二.產生發生同源重組之ES細胞
構築好標的載體後，一般是以效率較高之電穿孔方式將標的載體送入ES細胞中
為了篩選帶有標的載體之ES細胞，我們可以G418來篩選帶有neo的ES細胞
送入ES細胞之DNA大部分是以隨機的方法插入染色體內，此ES細胞就會同時帶有neo和TK或DT標記，這並不是我們要的ES細胞，但G418藥劑不會殺死這些細胞
基因標的法
改變特定染色體基因的方法
基因剔除
造成基因功能破壞之改變
三.篩選發生同源重組（或是基因剔除）之ES細胞
以幫助挑出發生同源重組之ES細胞
負向篩選標記
篩選標記的效果並不是百分之百
需要以南方墨點實驗進一步篩選確認有同源重組之ES細胞
正向篩選標記
做法
設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
一個切割位置位於標的載體一端以外之標的基因序列上
一個切割位置位於neo另一邊之標的序列上
利用標的載體以外之標的基因序列作為探針
如果是原來的基因體結構
偵測到之片段是4 kb
如果是有同源重組之基因體結構
多了neo，所以偵測到的片段是6 kb
如果是隨機插入
使用標的載體以外之標的基因序列作為探針，偵測不到任何片段
使用標的載體以外之標的基因序列作為探針，偵測不到任何片段
PCR也可用來篩選有同源重組之ES細胞
引子之設計
一個位於neo內
一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上
可分辨
非同源重組之ES細胞（做不出PCR產物）
同源重組（可做出PCR產物）
四.產生基因剔除小鼠
得到基因剔除之ES細胞後
圖8-5 產生基因剔除小鼠的方法
ES細胞和囊胚混合後可產生嵌合小鼠
ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因，囊胚帶有黑色毛色基因
ES細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞，嵌合小鼠和野生型黑毛小鼠交配，會生出非黑毛之小鼠
囊胚細胞發育成嵌合小鼠的生殖細胞
會生出黑毛小鼠
以此毛色篩選方法可方便地篩選掉大部分非基因剔除小鼠
其中非黑毛小鼠有一半的機會可遺傳到剔除之基因（因為ES細胞只有一套剔除基因，另一套是野生型基因）
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將此ES細胞以顯微注射打入囊胚(blastocyst)
再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內
ES細胞（灰色）會和野生型之囊胚細胞（黑色）混合，發育生長成一個混合之個體
稱為嵌合體(chimera)
由於ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因(Agouti)
囊胚細胞帶有隱性黑色毛色基因(nonagouti)
ES細胞可分化成任一個細胞
產生之嵌合小鼠(chimeric mice)身上的毛色
可能是黑色
可能是非黑色
判斷ES細胞發育成生殖細胞的機率
以非黑色毛色的比例來判斷
非黑色毛色越多
ES細胞發育成生殖細胞的機率越大
可將剔除之基因遺傳至後代的機會也就越大
表ES細胞佔嵌合體的比例越大
例子
經由和ES細胞同樣的篩選方法來篩選嵌合小鼠之後代（如南方墨點實驗或PCR），得到單套基因剔除小鼠(heterozygous gene knock-out mice)後，再使其互相交配，即可有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠(homozygous gene knock-out mice)。
目的
為了研究基因在生物體內之重要性
基本介紹
基因剔除是指將生物體身上每一個細胞的某個特定基因破壞掉，因為生物體沒有這個特定基因，不僅可看出此基因對生物體的重要性為何（若缺乏是否會致死），也可用來研究基因缺陷造成何種發育或是生理上之問題。
改造遺傳物質的方式
整個DNA片段插入
同源重組，也就是I的B和II的B互換
DNA互相交換
應用
條件性基因剔除
Flp-FRT系統
Cre-loxP系統
基本介紹
Cre是P1噬菌體的重組酶，loxP是一組含有34個特定核苷酸之序列，且具有方向性。
應用方面
在某特定組織做基因剔除
受特定藥物控制表現之啟動子來表現Cre
在特定發育時期做基因剔除
受特定荷爾蒙控制表現之啟動子來表現Cre
8-4基因突變的製作(10941004A、
基因剔除
作法
先將一已知基因以插入抗藥性基因片段(neo)方式置換掉基因
再研究此基因所影響之功能
相反方向思考
已有一突變的動物模式
利用此突變的動物模式研究造成此性狀的機制
DNA跳躍子(Transposon)
睡美人跳躍子(sleeping beauty，簡稱SB)
早期
原本在鮭魚基因體中的跳躍子
在一千四百萬年前插入基因體之後累積了一些突變，就不再動了
在1997年，科學家們將其改造，可以在人類細胞株基因體中再跳躍
現今
2005年，科學家們又成功地利用SB進行小鼠的突變篩選
當基因轉殖多個連續SB (T2/onc)的小鼠與帶有基因轉殖跳躍酶(SB10)的小鼠交配後
後代基因體中的SB即任意跳躍到各種不同的位置，SB的插入位置是TA序列
由於小鼠體內原本沒有這種跳躍子，因此很容易就找出位置
當跳躍酶不存在的狀況下，SB即不再跳躍
目前而言，它的跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變
目前有改良的跳躍酶(SB11)基因，可產生更大量的跳躍酶
配合更多的連續SB (T2/onc2)，而在基因體中可以跳得更多更廣
它所跳躍的範圍仍靠近原本的位置，這些都可能在逐一研究之後慢慢改良
PB跳躍子（PiggyBac，簡稱PB）
早期
在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入，而且沒有特定的區域
但需要是TTAA序列
原本在菜蛾基因體中的跳躍子，可以攜帶14 kb的DNA
相較於SB，PB在整個基因體中均可以任意跳躍
目前
這些非病毒攜帶的跳躍子不會引起病毒插入基因體所造成的種種影響
可能有機會取代病毒載體成為基因治療的新一代載體
2005年，中國大陸的復旦大學師生將這個系統成功地運用在人類細胞株及小鼠的基因轉殖系統，成為小鼠突變株篩選的另一個更有潛力的新工具
介紹
特性
可以插在基因體中的任何地方造成基因的破壞
只要找出跳躍子的位置，就知道是哪一個基因出了問題
跳躍元素
跳躍元素中更可攜帶其他標記基因，更可以進行大規模的篩選
早期發現
最早是在玉米中發現的，它可以造成隨機的紫色玉米粒
每一種跳躍子都需要相對的一種跳躍酶對跳躍子兩端的跳躍元素作用
讓它在特別的序列中跳進跳出
技術實施
在果蠅等實驗動物中均行之有年
在哺乳類動物中卻十分困難，因:
哺乳類基因體中有各種跳躍子，約佔基因體的40%區域
哺乳類的跳躍子在5千萬年前即不再跳動了
功用
可以插入基因體中的任何位置
近幾年
才有適合的跳躍子成功地在人類細胞及小鼠的基因體中跳躍
這些跳躍子最大的特色是沒有特定的宿主，異於以往對跳躍子的認知
存在
在生物體中有多種小型的DNA跳躍子
前言
前文所介紹之基因剔除法是將基因完全破壞掉
稱為基因剔除
若將基因標的法應用在多加東西至基因內而不是刪除東西
使外來基因之表現可受此基因之啟動子所調控
特稱為基因殖入
可利用基因標的法將內源基因做點突變
位在啟動子區域
可研究調控因子對基因表現之重要性
位在編碼區域
可研究蛋白質之突變對其功能有何影響
一、ENU (n-ethyl-n-nitrosourea)
是一種很有效率的突變劑
可以對DNA產生破壞
在基因體上會造成隨機的點突變
將ENU打入小鼠之生殖器官
可引發其生殖細胞產生基因突變
藉此可產生大量不同的突變鼠
ENU突變鼠計畫需要用到的資源及人力非常的龐大
以研究單位為主
先進國家皆已進行ENU突變鼠之篩選研究
此單位主要進行製造突變鼠
建立快速疾病表現型的篩選方法
找出人類疾病的相關基因
建立疾病之動物模式
開發出與疾病相關之預防和治療方法
帶動臺灣基因科技醫藥產業
8-2 基因轉殖 (10941050A 10941036A)
基因調控研究
以體外培養細胞，利用DNA轉染(transfection)
基因小鼠製造流程
1.設計轉殖基因(transgene)
啟動子(promoter)
控制基因表現
編碼區域(coding region)
經由轉錄和轉譯產生蛋白質
2.產生基因轉殖小鼠(transgenic mice)
1.以基因選值得到轉殖基因株
2.把DNA片段從質體分離純化出
3.顯微注射(microinjection)
把DNA(轉殖基因)打入單細胞受精卵
DNA隨機插入染色體一起複製而遺傳
4.送至假懷孕母鼠子宮內
19~20天生出小鼠
3.篩選基因轉殖小鼠
1.取得小鼠基因體DNA
2.剪0.5 cm 小鼠尾巴
純化出篩選的基因體DNA
3.利用PCR技術
1.設計可增幅轉殖基因部分序列引子
2.篩選出帶轉殖基因小鼠
使用南方墨點實驗(Southern blot)
1.偵測轉殖基因
2.以轉殖基因當作探針
3.在轉漬膜上測出含轉殖基因片段
4.計算轉殖基因套數(copy number)
統計數據
轉殖基因套數太多
抑制轉殖基因表現
轉殖基因的表現
轉殖基因插入之位置附近有靜默子(silencer)或加強子(enhancer)，這些都會影響轉殖基因的表現，會促進或抑制轉殖基因的表現。
轉殖基因常有異位性表現(ectopic expression)，也就是在不該表現的地方表現，因此檢查轉殖基因表現時要特別注意這部分。
應用
如果要研究一基因之啟動子區域，我們可在此啟動子後接上一報告者基因(reporter gene)，如此便可以報告者基因之表現量多寡來代表待研究之啟動子之強弱。
如果要分析一基因之產物，我們可在此基因前接特定之啟動子（視研究者需要而定），例如選用只在肝組織表現之啟動子，如此便可研究此基因在肝組織表現會有何影響。
此外也可在基因本身作定點突變，藉此在動物體內研究此突變對基因之產物的功能有何影響，或是此突變之產物對實驗動物會造成何種生理之改變。
8-1 小鼠早期胚胎發育的簡介(10941018A)
小鼠
壽命
為1.5~2.5年
繁殖
一年四季皆可繁殖(半夜交配)，妊娠所需的時間為19~20天，每胎約可產生6~8隻幼鼠，6週大的小鼠即性成熟
胚胎發育
1.受精後第0.5~2.5天為分裂期
2.受精後第3.5天，胚胎之細胞開始分化
3.最後內部緊密的細胞發育成內細胞質團（inner cell mass，簡稱ICM），外層細胞發育成滋養外胚層(trophectoderm)，胚胎中間形成一個空腔，此時之胚胎稱為囊胚(blastocyst)
內細胞質團（inner cell mass，簡稱ICM）
具有多元分化(pluripotent)的能力
ES細胞(胚胎幹細胞，Embryonic stem cell，ESCs)就是從內細胞質團培養而來
4.第4.5天時胚胎會著床至子宮內膜，胚胎發育進入原腸胚形成(gastrulation)
5.第19.5天發育成一完整個體
圖示
體積
一隻成鼠約為30~40克
母鼠
生理週期
生理週期為4天，每次約可排8~12個卵(最佳狀況下)
控制
促濾泡激素（follicle-stimulating hormone，簡稱FSH）
促黃體激素（luteinizing hormone，簡稱LH）
大量排卵
方式:施打於4~6週之母鼠
懷孕母馬血清性腺激素（pregnant mare’s serum gonadotropin，簡稱PMSG）和人類絨毛膜性腺激素（human chorionic gonadotropine，簡稱hCG）
功能
1.代替FSH和LH之功能
2.促使其大量排卵，每次約可排出20~30個卵
3.減輕收集受精卵和胚胎的工作量
假懷孕
原理
指正常母鼠和不孕公鼠交配後，其子宮會變化成適合使受精卵著床的狀況，但因公鼠不孕，故母鼠之卵子無法受精
