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CH7 聚合酶鏈反應, 10941001A, 10941001a, 10941019A, 10941021A, 10941040A -…
CH7 聚合酶鏈反應
7-2PCR的基本原理 10941030A
三磷酸去氧核苷酸 (dNTPs)
dNTP包含了四種同濃度的三磷酸去氧核苷酸
dTTP
dCTP
dATP
dGTP
一般dNTP的使用濃度是200~250 μM
如果要利用PCR合成帶有標記的DNA，可以在dNTP之中以一種帶有標記之三磷酸去氧核苷酸取代原本的三磷酸去氧核苷酸
MgCl2濃度
所有的熱穩定DNA聚合酶都需要游離型態的鎂離子(Mg2+)才有活性
一般販售熱穩定DNA聚合酶的公司都會隨著酵素附加三種試劑
含有1.5 mM MgCl2的緩衝液
不含MgCl2的緩衝液
MgCl2溶液
引子(Primers)
每一條的使用濃度為0.1~0.5 μM之間
濃度足夠進行30個循環的PCR反應
大部分的PCR實驗中，引子的設計常是決定PCR能不能成功最重要的因素
PCR的引子是以人工合成的寡聚核苷酸(oligonucleotide)
好的引子的條件
一條引子內不可出現會在引子內部產生互補的3個以上連續之鹼基
因為這種序列會在引子內形成分子內二級結構，因而影響引子和模板黏合的效率
G/C的比例，也就是(G+C)/(A+T)的值大約是40~60%，而且四種鹼基的分佈要平均
長度為18~25個鹼基，兩條引子的長度不可相差大於3個鹼基數
引子3'端之序列不可和其他的引子有互補的情形
兩條引子的解鏈溫度（melting temperature，簡稱Tm）要相近，不可相差5℃以上。
模板DNA (Template DNA)
模板DNA可以是雙股或是單股的DNA
模板DNA越純，PCR反應的成功機會就越大
模板DNA的量會影響PCR的結果
熱穩定DNA聚合酶(Thermostable DNA Polymerase)
目前最常用之熱穩定DNA聚合酶－Taq
Taq缺點
不具有校正(proofreading)之功能
合成之DNA片段的長度有限
從嗜熱性細菌Thermus aquaticus所分離出來的
7-1 PCR的基本原理與做法
引子接合
方法
降低溫度
目的
使引子與cDNA黏合
每一種引子和DNA模板黏合的溫度不同
55℃最佳。信號最強、背景值最低
延展
目的
合成與模板DNA互補的序列，形成新的雙股DNA
(普遍上)DNA聚合酶的延展最佳反應溫度72℃
方法
DNA聚合酶與引子3'端連接進行聚合反應
變性
方法
95℃ 加熱
目的
將雙股DNA分開，分別作為模板
PCR反應
(理論上)只要25個循環
產生標的片段DNA是10的6次方倍
反覆變化溫度
合成更多雙股DNA
一個PCR反應需要25~30個循環
等比級數增加標的片段的數量
PCR機器
使用熱穩定DNA聚合酶
導熱快速的金屬塊
溫度變化快速，且溫度穩定
7-3 PCR的應用
二、同步PCR 和定量PCR
用傳統PCR來定量
要對同一樣品同時做不同循環之反應，增幅出之產物要用電泳分離，再以溴化乙錠染色，或是南方墨點實驗來偵測產物
缺點:費時耗工、易汙染 優點:靈敏度高，所需時間少
同步PCR:螢光技術用在PCR產物之偵測+設計PCR儀器可同步進行PCR反應及偵測螢光
DNA結合染劑SYBR Green I
SYBR Green I會很特異地和DNA雙股螺旋的小溝結合，結合後會發出很強螢光，但SYBR Green I 可和所有DNA結合，所以無法分辨特異性產物及非特異性產物
雜交探針
兩條以相鄰方式可和標的片段雜交的寡聚合乾酸，位於5'端之嘆真的3'尾端標記了螢光轉位素，稱給予者；反之為接受者
給予者受到光源刺激會發出較短波長之螢光，但如果兩者靠太近，給予者會把能量給接受者，接受者就會發出教長波長之螢光
水解探針(Hydrolysis ，又名
TaqMan probe
:為一條寡聚合甘酸，兩端各標積了不同的螢光轉換素，再5'端為報告者，3'端為熄滅者
當報告者和熄滅者再同一條線上，報告者接受刺激後之發光能量會被熄滅者一至，所以波長較長
三、解鏈曲線分析
10941059A
目的
分析PCR之產物
解鏈溫度和DNA長度及G/C比例有關，因此解鏈溫度可以用來分辨產物中不同的DNA片段
偵測突變
基因型鑑定上可分辨成右邊波峰=同型野生型
左邊波峰=同型突變型
兩個波峰=異型突變型
一、反轉錄PCR( RT-PCR)
以反轉錄酶從RNA製造其互補DNA
再以cDNA當作模板
用兩股特定之引子做PCR，增幅特定之序列
製造cDNA時，依照不同之需求
使用oligo(dT)當作引子，可合成所有mRNA的cDNA
使用特定基因引子，則只會合成此基因之cDNA
隨機引子可黏合至RNA的任一個位置，合成出長度不一之cDNA
mRNA很長
mRNA內部有二級結構
四、鑑定科學
變異區分
限制酶切割位置
限制酶片段多型性RFLP
以PCR分析VNTR
增幅長度多樣性AMP-FLP
STR
由2-7個鹼基重複排列組成
長度約為100-400鹼基對 目前已知10萬個基因座
DNA多型性(變異性重複序列)VNTR
序列多列性
少數鹼基差異
長度多列姓
重複次數不同，長度而不同
STR鑑定身分
利用PCR增幅STR基因座
電泳方式分離不同長度DNA
比對STR基因座相似度鑑定身分
若無法來自單一檢體(如強暴犯檢測)
可分離出檢提 之後比對受害人和嫌疑犯是否有相對基因
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