生技概論 第九章 單株抗體及其應用發展
9-1 免疫系統及抗體(10941028A)
免疫系統
細胞免疫
體液免疫
由骨髓中的造血幹細胞分化而來的
由骨髓中的造血幹細胞分化而來的
造血幹細胞
血液中的血球細胞
淋巴細胞
再分化成可產生抗體的B淋巴細胞及T淋巴細胞
即成為人體免疫系統的重要成員
單株抗體
每個B細胞經過抗原的誘導所產生的抗體只針對抗原的一個epitope
多株抗體
一個抗原有多個抗原決定位，每一類B細胞認一個epitope，在血液中就有多株抗體來對抗同一個抗原，因此抗血清
B細胞產生的抗體
與免疫系統對付外來抗原最直接相關的是IgG
過敏反應則與IgE有關
IgA則是可隨同體液被分泌出來，如唾液、眼淚甚至乳汁中所含的抗體即屬於此類
9-2 單株抗體的原理 (10941018A)
原理基礎與延伸
每一個B細胞都能產生一種具有單一特性的抗體，且有一定壽命
從B細胞轉變來的腫瘤細胞稱為骨髓瘤(myeloma)是自然產生的，且它可以不斷分裂產生新細胞及單一抗體(蛋白質)
單株抗體製作原理
融合瘤的產生流程
Georges Kohler及Cesar Milstein在1975年發表
利用細胞融合的方式將特定抗原處理的B細胞及不產生抗體之骨髓瘤融合
特性
可以持續生長分裂
能針對已知抗原產生特定的抗體(即單株抗體(monoclonal antibody))
製作
正常的合成步驟
備用的補救途徑
全新合成(de novo pathway)(詳見圖例)
利用其他的中間產物來當原料
如果沒有HGPRT酵素，就無法利用這種途徑來合成核苷酸
圖例
1.老鼠注射X抗原
2.將製造B細胞的脾臟組織取出
3.利用PEG將他們和突變的骨髓瘤細胞融合
4.使用HAT培養基，阻礙合成核苷酸的正常途徑
5.篩選前將細胞稀釋成每個槽中只有一個細胞，再由這個細胞長成一“株”細胞
6.抗原篩選，確認是認識X抗原
7.經過稀釋培養，再篩選，以保證每株融合瘤細胞都是從一個細胞分裂而來
篩選方式:免疫反應
免疫放射分析（radioimmunoassay，簡稱RIA）
常用:ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
流程圖
圖示
1.將抗原固定在96孔的培養盤
2.加入培養過融合瘤的培養液，此培養基中含有融合瘤分泌出的單株抗體
3.再加入帶有酵素的二次抗體
4.以反應強度來判斷該抗體的強弱
9-5 單株抗體在臨床上的應用(10941004A)
截至2001年5月，有登記為醫療研發目的的186種單株抗體中，核准上市的只有10種
自1980~2005年止，單株抗體在臨床上的成績
單株抗體仍是目前除了疫苗以外
表9-5為目前美國已核准上市的25種單株抗體，以及這些成功的單株抗體在臨床上的用途
人類及其他動物都有天生的免疫防禦能力
治療理論上，科學家只要能有效利用人體的自然防禦機制，應該就能充分克服各種如癌症、腫瘤等難纏的疾病
各藥廠及實驗室研發數量最高的治療項目
因其特殊的專一性極具潛力
其可用來利用作為治療藥物的機制如下：
阻擾重要的細胞生長因子或受體。
直接引起細胞凋零(apoptosis)。
抓住標的細胞，召喚其他如抗體引起的細胞毒弒作用或補體毒弒作用。
攜帶具細胞毒性的放射性元素或毒素至標的細胞
包括有自體免疫、癌症、病毒及細菌感染等疾病。
近年來由於單株抗體的改良，也提高了臨床試驗的成功率
例如
人類化及嵌合式單株抗體都有令人振奮的表現，在此十種單株抗體中，有五種是人類化單株抗體，四種為嵌合式單株抗體
從統計數字中可看出此兩類抗體的核准成功率均有1/4左右
而其中較晚開始的人類化單株抗體較具潛力，增加了之後的成功機率
介紹
人類化單株抗體技術是由Protein Design Labs (PDL)公司研發出來的，目前以技術轉移的方式供製藥公司使用
人類化抗體的發展成功可說是單株抗體在臨床應用的一個新的里程碑，也奠定了此項技術在臨床應用時的新標準
在2002年底，第一個由噬菌體表現的抗體即已成功上市成為新藥，足見此技術之潛力，有更多的公司投入此領域
由於此技術的產品專一性高，療效卓著，是目前成長最快速的蛋白質藥物
9-4 單株抗體的量產 (10941050A 10941031A)
傳統方式
目前方式
中國鼠卵巢細胞株(CHO)
小鼠骨髓瘤細胞株(NS0)
細胞株中培養
單株抗體為重組蛋白質
二、酵母菌系統
三、哺乳動物細胞培養
一、細菌生產
四、基因轉殖動物
缺點
使用情形
優點
無醣化作用，無法對人體蛋白質修飾
便宜
不發生醣化作用的抗體片段才能量產
腫瘤細胞的穿透性較佳，可使用抗體片段
缺點
酵母菌醣化作用結構與哺乳類差異大
優點
缺點
完整抗體為複雜分子，非最佳量產來源
可用於量產完整抗體
原理
將帶有重組抗體基因的質體插入染色體中
穩定安全
成本高
優點
能提供需求量大的抗體試驗
相較細菌培養便宜
五、基因轉殖植物
目前方式
9-7單株抗體的其他價值(10941036A)
click to edit
- 找出特定細胞特別表現的特徵：目前對白血球中淋巴細胞及吞噬細胞的分類，都是靠多種能夠分辨這些細胞表面不同特定標記的單株抗體來區別，其能夠區分各個分化階段的不同細胞族群。
- 免疫鑑定：許多感染或全身性的疾病，需要靠一些單株抗體來鑑定在血液或組織中的特殊抗原或抗體，以確認病因或病情。例如B型肝炎感染，可藉由不同的抗體來鑑別病人體內是否會產生具有感染力的病毒，或只是不具感染力的帶原者。
- 腫瘤鑑定及治療：除了以單株抗體進行腫瘤治療之外，許多腫瘤細胞都會出現特定的抗原，利用單株抗體可以辨認組織是否已癌化，或是處於癌變的何種時期。
- 蛋白質功能分析：例如細胞功能分析，可以利用單株抗體與細胞表面分子結合，可能刺激或抑制某些細胞功能，進而瞭解該分子在細胞功能上所扮演的角色。
缺點
原理
以基因槍的方式製作基因轉殖植物
誘導
植物中碳水化合物的組成方式與哺乳類動物十分不同，以致於許多醣化作用的結果有差異
六、其他製作單株抗體的技術
9-3 嵌合式單株抗體的發展(10941053A)
傳統單株抗體是第一代抗體
在1980年代早期
雖然在實驗診斷上十分有用，但並不適合於人體醫療
單株抗體在臨床試驗上多為失敗收場
唯一的例外
1986年美國食品藥物管理局核准
muromonab-CD3
用來避免急性排斥
由於病人已經施以其他降低免疫反應藥物，免疫力極低，體內的免疫反應十分不靈敏
因此不會將之排除
人類融合瘤即是使用相同方式產生的
但由於人類的B細胞株十分不穩定，不如老鼠的B細胞株，只能產生少數的抗體
重組單株抗體的目的是為了能讓人體接受
不產生排斥
9-6 單株抗體在癌症治療的應用(10941044A)
儘管單株抗體在臨床應用上開始漸露曙光，但對於腫瘤的治療效果仍十分有限，可能因為抗體很難進入腫瘤細胞，或是單只靠抗體所引起的細胞毒弒作用(cytotoxicity)並不足以殺死惡性腫瘤。
針對這樣的問題，科學家們開始對抗體進行一些改造，如增加毒性的免疫毒素，增加抗體反應具雙重專一性(bispecific)的雙抗體分子等，以期能增加對惡性腫瘤的消除效果。
在抗體標的選擇上，適合作為抗原的條件如下
- 在腫瘤細胞的表面且分子狀況穩定的
- 幾乎大部分的腫瘤細胞均有表現，或多種腫瘤均會表現
- 在癌細胞中表現量高，或在正常細胞中完全不表現的
- 該分子的功能與腫瘤的形成過程關係密切
根據以上這些條件，目前已核准的或在臨床實驗末期的治癌單株抗體藥物多為針對下列分子所產生的抗體
- 細胞表面受體
如參與腫瘤癌化的細胞訊息傳遞的Tyrosine激化酶
- CD（cluster of differentiation，分化叢集分子）
- Oncofetal蛋白質
- 腫瘤的血管組織(vasculature)
這類分子如CD20、CD22、CD33及CD52等已知在腫瘤細胞之表面均會過量表現，特別是造血幹細胞(hematopoietic)來源者
這類蛋白質的定義是指只在胚胎時期會短暫表現，成體不表現，但在癌細胞中又再度不正常表現的蛋白質
由於腫瘤的生長與血管新生作用(angiogenesis)有密切關係，以腫瘤的血管作為標的有多種優於傳統細胞毒弒作用的好處
(2) 適用於各種腫瘤
(3) 對正常細胞無毒害
(4) 更能有效阻止癌細胞移轉(metastasis)所造成的癌細胞擴散現象
- 腫瘤間質(stroma)
(1) 抗原在腫瘤內皮細胞(endothelium)穩定表現，不太容易產生抗藥性
- 支持療法
因此抗血管新生藥物也成為目前治癌藥物中較具吸引力的一個方向之一，只要有效阻撓參與血管新生作用的各種訊息傳遞途徑，即可達到目的
有越來越多的研究顯示腫瘤細胞間質與癌細胞之間的關係密切，如細胞基底層(basement membrane)的性質及成分等，對癌細胞從生長到癌細胞移轉均有影響
單株抗體不僅可以用於治療癌症，也可以提供癌症病人支持療效
例如已知TNF-α(tumor necrosis factor a)與癌症病人的體重減輕及體能消耗現象(cachexia)有密切關係，以單株抗體阻礙TNF-α的功能，即可減緩病人衰弱的症狀
在實際使用抗體治療時，不僅可以直接阻撓蛋白質的功能，同時也可以利用下列方式來達到毒弒腫瘤細胞的目的
- 放射性標記的抗體
- 免疫毒素
- 攜帶藥物前驅體(precursor)
- 免疫酵素
將放射性物質與抗癌抗原的抗體結合，讓抗體把放射性物質帶至癌細胞，並將癌細胞殺死
這種技術有其缺點，由於治療癌症的放射性元素只需低劑量即有效果，難保抗體不會將放射性物質送至正常的組織；另一方面，對於代謝這類分子的器官如肝臟，也可能有毒害作用
再者，帶有放射性物質的抗體，雖然仍具有專一性，卻可能因此改變在體內原本的醫療特性，目前已上市的Zevalin及Bexxar（見表9-5）是這類抗體的成功代表
簡單的說，就是將生物性的毒素蛋白與抗體結合，利用抗體將毒素帶至癌細胞，例如細菌的毒素即可與認識癌細胞的抗體結合，將毒素帶至癌細胞，但由於能攜帶的劑量十分低，對於惡性腫瘤的清除仍不太有效。
目前已上市的Mylotarg（見表9-5）攜有細菌的Calicheamicin毒素，會與DNA結合，使DNA斷裂，進而細胞凋零，是此類代表
另一種方式是將藥物前驅體分子與抗體結合，當抗體到達癌細胞之後，藥物前驅體分子即可進入細胞，並轉變成真正的藥物，進而清除惡性腫瘤
將酵素與抗體結合，讓抗體攜帶酵素至腫瘤，然後施以藥物前體(prodrug)，酵素即可在細胞上將藥物前體轉化成為真正的藥物，如圖9-8