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Ch7 PCR 聚合酶連鎖反應 - Coggle Diagram

- - - - RT-PCR的第一步是以反轉錄酶(reverse transcriptase)從RNA製造其互補DNA(complementary DNA，簡稱cDNA)，再以cDNA當做模板，用兩股特定之引子做PCR，增幅特定之序列
    - - 製造cDNA時，依照不同之需求，可使用寡聚胸苷酸(oligo(dT))引子，或是特定基因之引子(gene-specific primer)，或是隨機引子(random primers)
        
        mRNA的3'端帶有一段聚合腺苷酸尾巴(poly A tail)，若是使用 oligo(dT)當作引子，則可合成所有mRNA的cDNA
        
        而隨機引子是長度為6個鹼基之寡聚核苷酸，但鹼基之種類及順序是隨機組成的，因此隨機引子可黏合至RNA任一個位置，合成出長度不一之cDNA，在mRNA很長，或是mRNA內部有二級結構，使cDNA合成效率很差時，就可用隨機引子來替代其他引子
        
        若是使用特定基因引子，則只會合成此基因之cDNA
    - - 一般之PCR是以DNA當做模板，但在一些實驗中，我們想增幅之模板卻是RNA，因此當mRNA的量非常少時，就可利用RT-PCR的技術
  - - - 缺點:耗時費工，易造成污染，且電泳分析之靈敏度也不高。
      - 進行PCR過程時也可同時測量PCR產物，這種技術稱為同步PCR。
        
        好處除了靈敏度較高（因螢光偵測較靈敏），所需之時間較少（不需做電泳分析及染色）
  - - - SYBR Green I會特異性地和DNA雙股螺旋的小溝結合，單獨的SYBR Green I會發出少量背景值螢光，但和DNA結合後會發出很強的螢光
      - SYBR Green I可和所有的雙股DNA結合，無法分辨特異性PCR產物和非特異性PCR產物，可用解鏈曲線分析來區分
    - - 5'端之探針的3'尾端標記的螢光轉換素稱為:給予者
        3'端之探針的5'尾端標記的螢光轉換素稱為:接受者
      - 給予者受到光源刺激會發出較短波長之螢光，但給予者和接受者靠很近時，給予者會把光源刺激的能量傳給接受者，接受者就會發出另一較長波長之螢光。
      - PCR過程中，雜交探針可在引子黏合的步驟和標的片段結合，此時可測量較長波長之螢光量，此螢光量代表每次PCR循環產生了多少的PCR產物。
    - - 是一條寡聚核苷酸，在5'端的稱為報告者，3'端的稱為熄滅者
      - 報告者和熄滅者在同一條寡聚核苷酸上時，報告者接受刺激後發出之螢光波長較長。
      - Taq聚合酶由引子尾端進行聚合反應，遇到水解探針時，Taq聚合酶的外切核酸酶會水解掉水解探針，報告者便會被釋放出來，其發出之螢光的能量就不再被熄滅者所抑制，此時發出較短波長之螢光，因此當PCR產物越多，被釋放出之報告者就越多，短波長螢光也就越強。
      - 水解探針是特異性地和標的片段結合，因此不會偵測到非特異性之產物
    - - 用同步PCR來做定量的方法為:
        
        機器在PCR循環可測到螢光值，循環數目對螢光值可畫出曲線圖，找出每一種模板濃度，螢光值進入log直線區域的那一點，點都位在同一直線上，此稱交叉直線，利用不同模板濃度之log值和其交叉直線上的循環次數，可畫出迴歸直線，可作為標準曲線。
      - 定量方法可分絕對定量和相對定量，絕對定量要使用已知濃度之模板做出一條標準曲線，利用此標準曲線算出樣本的真正濃度
        
        相對定量之目的是比較不同樣本之間的差異。
  - - - 不適用於水解探針，因水解探針在PCR過程中已被水解
    - - 在進行完PCR反應後，持續增加溫度並同時記錄螢光值之變化，可得到如圖7-9(b)的曲線圖
      - 當溫度到達解鏈溫度時，雙股DNA分開，螢光值會驟降，但在10套和104套的曲線可看出有兩次的溫度驟降，這代表有兩種PCR產物。
      - 因為螢光值對溫度的曲線圖較難看出差異，所以我們可以對曲線做一次微分（代表每單位溫度螢光的變化），相對於溫度重新畫出圖7-9(c)的曲線圖
    - - 圖7-10 利用雜交探針和解鏈曲線分析來偵測突變
        
        (a) 雜交探針可雜交至點突變的位置，雜交探針和點突變的錯誤配對會降低解鏈溫度
        
        (b)螢光值vs.溫度的曲線圖
      - 0套的曲線沒有模板DNA就沒有右邊的波峰，但有左邊引子二聚物的波峰；而模板數量少，能得到的特異性產物相對的也較少，因此10套的曲線其右邊波峰較104套低。
      - 使用SYBR Green I做完PCR後可以用解鏈曲線分析是否有非特異性產物，如果有，就必須更改PCR反應條件或重新設計引子，以去除非特異性產物的產生。
      - 除了可辨別產物特性，解鏈曲線分析還可用來偵測突變，如圖7-10，
        如果將雜交探針設計成可雜交至突變點的位置，完成PCR反應後，進行解鏈曲線分析，因錯誤配對(mismatch)會降低解鏈溫度，所以從圖7-10(c)可看出右邊波峰代表野生型，左邊波峰代表突變型，在基因型(genotype)鑑定上可分辨成如果只有右邊波峰代表是同型野生型(homozygous wildtype)，如果只有左邊波峰代表同型突變型(homozygous mutant)，而如果兩個波峰都有，就代表異型突變型(heterozygous mutant)。
    - - 鑑定PCR的產物
      - 偵測突變
    - - SYBRT Green 1
      - 雜交探針PCR
  - - - 序列多型性(sequence polymorphism)，是因為基因序列上有少數鹼基差異而產生的多型性
      - 長度多型性(length polymorphism)，是重複DNA序列所造成，因DNA重複之次數不同，因而長度不同。
        
        其中長度多型性DNA稱為變異性重複序列（variable number tandem repeat，簡稱VNTR），
    - - 因PCR可以分析非常少量的DNA（只有nanograms的DNA也可做到），而且即使檢體之DNA有部分被分解，因STR的長度很短（100~400鹼基對），所以PCR技術還是可以增幅且分析STR。
      - 如圖7-11(a)，以親子鑑定為例，利用PCR增幅STR基因座之後，再以電泳方式分離不同長度之DNA片段，Y樣品帶有AB片段，Z樣品帶有BC片段，對X樣品而言，它的A片段可從Y遺傳而來，C片段可從Z遺傳而來，因此X可能是Y與Z之子女，只要再比對更多的STR基因座，即可更進一步確定X是否為Y與Z之子女。
      - 在犯罪案件中，如果被害人與嫌疑犯之檢體無法分離，例如在強暴案件中由陰道採得之精液檢體（含有精子細胞和陰道細胞），如圖7-11(b)，分析STR系統可知，M檢體之結果包含了ABCD片段，而被害人有AB片段，嫌疑犯有CD片段，因此精液有可能來自此嫌疑犯。
        
        除了STR系統之外，粒線體DNA（mitochondrial DNA，簡稱mtDNA）也常作為一種鑑識方式。
        
        在精子與卵子結合過程中，精子只有細胞核（帶有遺傳物質）會進入卵子內而形成受精卵，因此從受精卵發育完成之個體的粒線體（位於細胞質內）是完全遺傳自母親一方。
        
        粒線體本身含有單套的遺傳物質，其遺傳方式不同於細胞核內雙套基因體的孟德爾遺傳定律方式，稱為母系遺傳(maternal inheritance)。
        
        一個細胞可有數百至數千個粒線體，也就是說一個細胞可帶有數百至數千個套數(copy number)的mtDNA，因此當檢體數量非常少或是嚴重腐敗時，mtDNA可用作鑑識的方法。
        
        在mtDNA內有兩段高變異區域(hypervariable regions)－HV1及HV2，以PCR方式增幅HV1和HV2後，再定出其DNA序列，比較HV1和HV2之DNA序列，若有同一母系親緣關係的個體會有共同的相似差異度，此法可鑑定兩個體是否為同一母系而來。
- - - - dTTP
      - dCTP
      - dATP
      - dGTP
  - - - 長度為18~25個鹼基,兩條引子長度相差不可大於3個鹼基數
      - 一條引子內不可出現會在引子內部產生互補的3個以上連續之簡基
      - G/C的比例,也就是(G+C)/(A+T)的值大約是40~60%,而且四種鹼基的分布要平均
      - 引子3端之序列不可和其他引子有互補情形
      - 兩條引子的解鍊溫度(melting temperature,簡稱Tm)要相近
    - - 濃度0.1~0.5µm
      - 人工合成的寡聚合甘酸(oilgonucleotide)
      - 引子是決定PCR會不會成功因素之一
  - - - 從嗜熱細菌Thermus aquaticus所分離出來
      - 缺點
        
        合成之DNA片段長度有限,他不具有校正(PROOFREADING)功能,因此會出錯,錯誤率為1.3X10-5
    - - 正確度(Accuracy)
      - 速度
      - 校正力(proofeading)
      - 熱啟動(Hot Start)
      - 耐熱性
- - - - PCR由下列三個步驟不斷反覆而成
        
        變性(denaturation)
        
        以95℃加熱的方式將模板(template)雙股DNA分開。
        
        引子黏合(primer annealing)
        
        此時要降低溫度，使引子可與序列互補(complementary)的單股模板DNA特異性地黏合。
        
        由於每一種引子和模板DNA黏合所需的溫度不同，每對引子均需先測試出一個信號最強，背景值最低之引子黏合溫度，一般是55℃左右。
        
        延展(extension)：
        
        DNA聚合酶可接著引子3'端進行聚合反應，合成與模板DNA互補的序列，形成新的雙股DNA。
        
        一般DNA聚合酶的延展最佳反應溫度是72℃。
    - - 一般一個PCR反應需進行25~30個循環，此種增幅方式是以等比級數增加標的片段的數量，因此理論上來說，只要進行25個循環，可產生之標的片段DNA是106倍於模板DNA數量。
      - 一般進行PCR反應的機器基本上是一個導熱快速的金屬塊，其上有凹槽，只要將PCR反應所需之試劑全放入管子內，再將管子放入金屬凹槽，設定好實驗者需要的程式後，機器便可自動控制溫度變化及反應時間
      - PCR機器最基本的要求是溫度的變化要夠快，到達設定溫度以後，溫度之維持必須要穩定。