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Hibridación de los ácidos nucleicos - Coggle Diagram
Hibridación de los ácidos nucleicos
Consiste en
La unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas originando una molécula híbrida bicentenária.
Factores que influyen en la hibridación
Agentes desnaturalizantes
Porcentaje de bases no complementarias
Fuerza iónica de la solución
Tipos y características de las sondas
Sondas de ADN pueden ser
De síntesis química
De ADN recombinante
PCR
Sondas de ARN
Según el proceso de obtención
De síntesis química
Transcripción
Pueden ser
Bicatenarias
Monocatenarias
Oligonucleicos o grandes moléculas
Dependerá de
La especifidad
La sensibilidad
El marcaje de las sondas
Tipos de marcadores
Que posibilitan la detección directa del híbrido
Isótopos radioactivos
Fluorocromos
Que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos
Haptenos
Digoxigenina
Biotina
Métodos de marcaje
Marcaje terminal
Marcaje. Por PCR
Cebado al azar o cebado aleatorio
Marcaje de sondas de ARN
Desplazamiento de mella
Fases de la hibridación
Hibridación
Es importante tener en cuenta
Las condiciones y reactivos empleados
El tiempo
LaTm del híbrido
Lavado de poshibridación
Preparación de la muestra y soporte(prehibridación)
Detección del híbrido
Según el tipo de marcador
Fluorocromos
Técnicas de hibridación in situ
Haptenos
Todo tipo de técnicas
Marcaje radiactivo
Técnicas de hibridación sobre soporte
Desnaturalización
Es una propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias
Se consigue
Aumentando la temperatura
Mediante la curva de fusión
Si la molécula es menor de 500pb(depende de la longitud)
Si la molécula es mayor a 500pb(depende de la proporción de GC)
Aumentando el PH(alcalino)
Renaturalización
Proceso por el cual las dos cadenas de una molécula ADN completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasoociarse al bajar lentamente la temperatura,hasta formar la doble hélice original
Fases
Primera fase o fase de nucleación
Fase lenta en la que secuencias cortas de bases complementarias se aparean por formación de puentes de hidrógeno
Segunda fase o fase de cierre de cadena
Fase rápida en la que se produce el cierre de las secuencias vecinas originando la doble hélice
Es importante
Concentración
Cuanta más concentración más velocidad de renatularización
Complejidad ADN
Cuanta mas complejidad del ADN menos velocidad de renaturalización