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生技概論第七章聚合酶鏈反應 - Coggle Diagram

- - - - 可合成所有mRNA的cDNA
    - - 只會合成此基因之cDNA
  - - - 因此隨機引子可黏合至RNA的任一個位置，合成出長度不一之cDNA
  - - - 可使用隨機引子來替代其他引子
- - - - 一般PCR反應是使用200 μM的dNTP配1.5 mM的MgCl2，但因為dNTP、寡聚核苷酸、焦磷酸根(pyrophosphate, PPi)及EDTA都會和鎂離子結合，因此最佳的鎂離子濃度對不同的PCR反應是不同的。
    - - 含有1.5 mM MgCl2的緩衝液
      - 不含MgCl2的緩衝液
      - MgCl2溶液
  - - - 人工合成的寡聚核苷酸(oligonucleotide)
    - - 0.1~0.5 μM之間
    - - 一條引子內不可出現會在引子內部產生互補的3個以上連續之鹼基
      - 3.(G+C)/(A+T)的值大約是40~60%，而且四種鹼基的分佈要平均。
      - 1.長度為18~25個鹼基，兩條引子的長度不可相差大於3個鹼基數。
      - 4.引子3'端之序列不可和其他的引子互補，否則將產生引子二聚物(primer dimer)
      - 5.兩條引子的解鏈溫度（melting temperature，簡稱Tm）要相近，不可相差5℃以上。
    - - 引子二聚物
        
        定義
        
        引子互相黏合，且互為模板而進行聚合反應，消耗可和模板黏合的引子、聚合酶及dNTPs等，進而減少了標的DNA之增幅效率。
      - 解鏈溫度
        
        定義
        
        50%的DNA為單股時的溫度，主要和DNA的長度以及G/C比例有關
        
        方程式
        
        Tm (℃) = 2(A+T) + 4(G+C)
  - - - 單股的DNA
      - 雙股的DNA
    - - 模板DNA的純度
      - 模板DNA的量
    - - 人類基因體DNA需要500 ng的模板DNA
      - 質體DNA需要0.1~1 ng的模板DNA
  - - - 來源
        
        嗜熱性細菌Thermus aquaticus所分離出來之產物
      - 缺點
        
        1.合成之DNA片段的長度有限
        
        2.不具有校正(proofreading)之功能，錯誤率約為1.3×10–5 (又稱忠實度(fidelity)不高)
  - - - 四種同濃度的三磷酸去氧核苷酸：dATP、dTTP、dCTP和dGTP
    - - 作為合成DNA的受質(substrate)
    - - 一般是200~250 μM，也就是dATP、dTTP、dCTP和dGTP各是200~250 μM
    - - 如果要利用PCR合成帶有標記的DNA，可以在dNTP之中以一種帶有標記之三磷酸去氧核苷酸取代原本的三磷酸去氧核苷酸
        
        舉例
        
        以放射性元素32P標記之dCTP取代單純之dCTP，或是DIG標記的dATP
- - - - 以0套、10套和 10的4次方套的模板為例
        
        即使是不加模板，若是引子自己即可配對
        
        以SYBR Green I為染色方式
        
        可以偵測到螢光的增加
        
        表示SYBR Green I染色無法分辨非特異性產物
      - 在進行完PCR反應後
        
        持續增加溫度並同時記錄螢光值之變化
        
        可得到如圖7-9(b)的曲線圖
        
        當溫度到達解鏈溫度
        
        雙股DNA分開螢光值會驟降
        
        在10套和 10的4次方套的曲線可看出有兩次的溫度驟降
        
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    - - 因為螢光值對溫度的曲線圖較難看出差異
        
        做一次微分
        
        代表每單位溫度螢光的變化
        
        相對於溫度重新畫出圖7-9(c)的曲線圖
        
        三個不同濃度模板的差異就比較容易分辨
        
        位於左邊
        
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        位於右邊
        
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        0套的曲線沒有模板DNA
        
        沒有右邊的波峰
        
        有左邊引子二聚物的波峰
        
        模板數量少
        
        能得到的特異性產物相對的也較少
        
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  - - - 有
        
        必須更改PCR反應條件或重新設計引子
        
        以去除非特異性產物的產生
  - - - 圖7-10 利用雜交探針和解鏈曲線分析來偵測突變
        
        (a) 雜交探針可雜交至點突變的位置，雜交探針和點突變的錯誤配對會降低解鏈溫度
        
        (b)螢光值vs.溫度的曲線圖
        
        如果將雜交探針設計成可雜交至突變點的位置
        
        完成PCR反應
        
        進行解鏈曲線分析
        
        因錯誤配對(mismatch)會降低解鏈溫度
        
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  - - - 水解探針在PCR過程中已被水解
  - - - 用來分辨產物中不同的DNA片段
  - - - 在PCR完成後利用解鏈曲線(melting curve)來分析PCR之產物
        
        用途
        
        為PCR產物之鑑定及偵測突變
- - - - 不同的個體其STR的長度不同，作為鑑定一個人身分的方法，而且分析STR比分析其他DNA多型性快速且方便，所以較常被使用
  - - - 以親子鑑定為例，利用PCR增幅STR基因座之後，再以電泳方式分離不同長度之DNA片段
  - - - HV1
      - HV2
- - - - 偵測PCR產物
    - - 耗時
      - 易被汙染
      - 電泳分析靈敏度不高
  - - - 優點
        
        靈敏度較高
        
        所需時間較少
        
        可隨時定量
    - - 雜交探針(Hybridization probe)
        
        5' 探針的3'尾端標記螢光轉換素
        
        給予者(Donor)
        
        受光源刺激發出短波長螢光
        
        3'探針的5'尾端標記螢光轉換素
        
        接受者(Acceptor)
        
        兩者靠近時給予者把能量轉給接受者
        
        接受者發出波長較長螢光
        
        測量螢光量得知每次PCR循環產生多少產物
      - 水解探針(Hydrolysis probe)
        
        5'端標記螢光轉換素
        
        報告者(Reporter)
        
        3'標記螢光轉換素
        
        熄滅者(Quencher)
        
        在同一條寡聚合苷酸上時
        
        報告者接受刺激後發光能量會被熄滅者抑制
        
        發出螢光波長較長
        
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        應用
        
        使用帶有5'至3'外切核酸酶活性的特殊Taq聚合酶
        
        水解水解探針
        
        報告者被釋放，放出波長較短之螢光
        
        缺點
        
        無法偵測到非特異性之產物
      - DNA結合染劑SYBR Green I
        
        優點
        
        可透過DNA的螢光強弱測量產物
        
        缺點
        
        無法分辨特異性與非特異性PCR
        
        利用解鏈曲線分析
    - - 定量的方法
        
        相對定量
        
        比較不同樣本之間的差異，計算方式之原理和絕對定量一樣，例如我們想比較兩組不同處理之樣本的基因表現量是否有差，兩組樣本同時進行標的基因以及參考基因(reference gene)之比較，一般是使用固定表現基因(housekeeping gene)作為參考基因，且其表現必須不受實驗處理所影響之PCR，利用上述之計算方法，得到個別PCR結果之相對值，再以參考基因進行標的基因的校正，這樣就可以得到這兩組樣本標的基因的相差倍數
        
        絕對定量
        
        要使用已知濃度之模板做出一條標準曲線，利用此標準曲線可算出樣本的真正濃度
    - - 同步PCR還有一項特點是可以在PCR完成後利用解鏈曲線(melting curve)來分析PCR之產物，用途為PCR產物之鑑定及偵測突變。
        
        解鏈溫度和DNA長度及G/C比例有關，因此解鏈溫度可以用來分辨產物中不同的DNA片段。
        
        解鏈曲線分析可以應用在使用SYBR Green I以及雜交探針的PCR，但卻不適用於水解探針，因水解探針在PCR過程中已被水解。
        
        除了可辨別產物特性，解鏈曲線分析還可用來偵測突變
    - - 在人類的基因體中，有許多地方存在著DNA多型性(DNA polymorphism)，可以用來作為人類DNA之檢測。
      - DNA多型性分為兩類：序列多型性(sequence polymorphism)，是因為基因序列上有少數鹼基差異而產生的多型性；長度多型性(length polymorphism)，是重複DNA序列所造成，因DNA重複之次數不同，因而長度不同。其中長度多型性DNA稱為變異性重複序列
      - 在犯罪案件中，如果被害人與嫌疑犯之檢體無法分離，例如在強暴案件中由陰道採得之精液檢體（含有精子細胞和陰道細胞），分析STR系統可知，M檢體之結果包含了ABCD片段，而被害人有AB片段，嫌疑犯有CD片段，因此精液有可能來自此嫌疑犯。
      - 因PCR可以分析非常少量的DNA（只有nanograms的DNA也可做到），而且即使檢體之DNA有部分被分解，因STR的長度很短（100~400鹼基對），所以PCR技術還是可以增幅且分析STR。
        以親子鑑定為例，利用PCR增幅STR基因座之後，再以電泳方式分離不同長度之DNA片段，Y樣品帶有AB片段，Z樣品帶有BC片段，對X樣品而言，它的A片段可從Y遺傳而來，C片段可從Z遺傳而來，因此X可能是Y與Z之子女，只要再比對更多的STR基因座，即可更進一步確定X是否為Y與Z之子女。
- - - - PCR反應是以變性－引子黏合—延展三個步驟作為一個循環，反覆不斷進行多次
  - - - 此種增幅方式是以等比級數增加標的片段的數量
      - 只要進行25個循環，可產生之標的片段DNA是106倍於模板DNA數量
    - - DNA聚合酶可接著引子3'端進行聚合反應，合成與模板DNA互補的序列，形成新的雙股DNA
      - 一般DNA聚合酶的延展最佳反應溫度是72℃
    - - 一般進行PCR反應的機器基本上是一個導熱快速的金屬塊，其上有凹槽
      - 只要將PCR反應所需之試劑全放入管子內，再將管子放入金屬凹槽，設定好實驗者需要的程式後，機器便可自動控制溫度變化及反應時間
    - - 此時要降低溫度，使引子可與序列互補的單股模板DNA特異性地黏合
      - 由於每一種引子和模板DNA黏合所需的溫度不同，每對引子均需先測試出一個信號最強，背景值最低之引子黏合溫度，一般是55℃左右
    - - 以95℃加熱的方式將模板雙股DNA分開