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Cromatografía en fase líquida a columna abierta. - Coggle Diagram

- - - - Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados).
        
        Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia.
      - Cromatografía en gel.
        
        Cromatografía de intercambio iónico.
        
        Cromatografía covalente.
        
        Conformación de la cromatografía covalente.
        
        Fundamento de la cromatografía de afinidad.
        
        Cromatografía Flash.
        
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        Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad.
        
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        a) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2 maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.
        
        b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
        
        Es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar, las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la biología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito.
        
        El intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies iónicas de carga similar del analito.
        
        Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen el protón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones positivos.
        
        Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Los cambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un medio básico.
        
        Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir por cambio del pH.
        Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejos de carga negativa.
        
        La separación basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga durante una migración osmótica a través de geles. La filtración en gel es el método de separación que consiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas.
        
        Aplicaciones. Desalinización: Largas moléculas de origen biológico son separadas de especies ionizables o inorgánicas. Un ejemplo en la separación de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos, polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polímeros.
      - Cromatografía de partición de columna.
        
        Cromatografía de adsorción.
        
        Cromatografía de absorción y de partición de columna.
        
        Elución isocrática y gradiente.
        
        Procedimientos de elución.
        
        Aplicación de la muestra.
        
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        La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.
        
        Se lleva a cabo con un único disolvente. Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente continúo.
        
        Son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analito en la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria.
        
        Se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen.
        
        Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende del tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para la separación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes.
        
        Se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra o cualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente afín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa.
        
        Aplicaciones. Esta técnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o líquidos
        inmiscibles.