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生物技術概論, 10941003A, 10941017a, 10941054A, 10941024A, 10941005A, 10941042A -…

- - - - 同步PCR
        
        特點
        
        在PCR完成後可利用解鏈曲線(melting curve)來分析PCR之產物
        
        用途
        
        PCR產物之鑑定及偵測突變
      - 解鏈溫度
        
        和DNA長度及G/C比例有關
        
        可用來分辨產物中不同的DNA片段
      - 解鍵曲線分析
        
        應用
        
        使用SYBR Green I 以及雜交探針的PCR
        
        不適用
        
        水解探針
        
        因水解探針在PCR過程中已被水解
      - 圖7-9同步PCR之解鏈曲線分析
        
        進行完PCR反應後
        
        持續增加溫度並同時記錄螢光值之變化
        
        得到如園7-9（b）的曲線圖
        
        園7-9（b）的曲線圖
        
        當溫度到達解鏈溫度時
        
        雙股DNA分開，螢光值會驟降
        
        在10套和10'套的曲線可看出有兩次的溫度驟降，這代表有兩種PCR產物
        
        螢光值 vs.溫度的曲線圖
        
        螢光值對溫度的曲線圖較難看出差異
        
        對曲線做一次微分（代表每單位溫度螢光的變化）
        
        相對於溫度重新畫出圖7-9（c）的曲線圖
        
        圖7-9（c）的曲線圖
        
        容易分辨三個不同濃度模板的差異
        
        一次微分 vs.溫度的曲線圖
        
        波峰可代表Tm值
        
        左邊波峰代表引子二聚物之Tm值
        
        右邊波峰代表特異性產物之Tm值
        
        波峰
        
        左邊
        
        代表引子二聚物
        
        因為長度較短
        
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        右邊
        
        代表是標的產物
        
        溫度較高
        
        曲線
        
        0套
        
        沒有模板DNA
        
        沒有右邊的波峰
        
        有左邊引子二聚物的波峰
        
        10套
        
        模板數量少
        
        能得到的特異性產物相對的也較少
        
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        園7-9（a）的曲線圖
        
        不同量的模板做出之PCR曲線圖
        
        以0套，10套和10的4次方套的模板為例
        
        不加模板
        
        若是引子自己即可配對
        
        以SYBR Green為染色方式還是可偵測到螢光的增加
        
        表示SYBR Green | 染色無法分辨非特異性PCR產物之生成
        
        使用SYBR Green | 做完PCR後
        
        可以用解鏈曲線分析是否有非特性產物
        
        如果有就必須更改PCR反應條件或重新設計引子
        
        去除非特異性產物的產生
        
        偵測突變
        
        圖7-10
        
        圖7-10（a）
        
        如果將雜交探針設計成可雜交至突變點的位置
        
        完成PCR反應
        
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        圖7-10（b）
        
        螢光值 vs温度的曲線圖
        
        圖7-10利用雜交探針和解鏈曲線分析來偵測突變
        
        圖7-10（c）
        
        一次微分 vs.溫度的曲線圖
        
        可區分樣本的基因型
        
        波峰
        
        右邊
        
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        左邊
        
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        基因型（genotype）鑑定
        
        分辨
        
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  - - - 長度多型性(length polymorphism)
        
        重複DNA序列所造成，因DNA重複之次數不同，因而長度不同。
        
        長度多型性DNA稱為變異性重複序列（variable number tandem repeat，簡稱VNTR），
        
        早期這些變異是以限制酶切割位置來區分，稱為限制酶片段多型性（restriction fragment-length polymorphism，簡稱RFLP）；之後，利用PCR技術來分析VNTR，稱為增幅長度多型性（amplified fragment-length polymorphism，簡稱AMP-FLP）。
      - 序列多型性(sequence polymorphism)
        
        因為基因序列上有少數鹼基差異而產生的多型性
    - - 分析STR比分析其他DNA多型性快速且方便，所以較常被使用。
      - 因PCR可以分析非常少量的DNA（只有nanograms的DNA也可做到），而且即使檢體之DNA有部分被分解，因STR的長度很短（100~400鹼基對），所以PCR技術還是可以增幅且分析STR。
        
        如圖7-11(a)，以親子鑑定為例，利用PCR增幅STR基因座之後，再以電泳方式分離不同長度之DNA片段，Y樣品帶有AB片段，Z樣品帶有BC片段，對X樣品而言，它的A片段可從Y遺傳而來，C片段可從Z遺傳而來，因此X可能是Y與Z之子女，只要再比對更多的STR基因座，即可更進一步確定X是否為Y與Z之子女。
        
        如圖7-11(b)，分析STR系統可知，M檢體之結果包含了ABCD片段，而被害人有AB片段，嫌疑犯有CD片段，因此精液有可能來自此嫌疑犯。
    - - 粒線體本身含有單套的遺傳物質，其遺傳方式不同於細胞核內雙套基因體的孟德爾遺傳定律方式，稱為母系遺傳(maternal inheritance)。
        
        一個細胞可有數百至數千個粒線體，也就是說一個細胞可帶有數百至數千個套數(copy number)的mtDNA，因此當檢體數量非常少或是嚴重腐敗時，mtDNA可用作鑑識的方法
        
        在mtDNA內有兩段高變異區域(hypervariable regions)－HV1及HV2，以PCR方式增幅HV1和HV2後，再定出其DNA序列，比較HV1和HV2之DNA序列，若有同一母系親緣關係的個體會有共同的相似差異度，此法可鑑定兩個體是否為同一母系而來。
  - - - 在這些實驗中，尤其是當mRNA的量非常少時，我們就可利用到RT-PCR的技術。
    - - 在製造cDNA時，依照不同之需求，可使用寡聚胸苷酸(oligo(dT))引子，或是特定基因之引子(gene-specific primer)，或是隨機引子(random primers)。
        
        因為mRNA的3'端帶有一段聚合腺苷酸尾巴(poly A tail)，若是使用oligo(dT)當作引子，則可合成所有mRNA的cDNA；若是使用特定基因引子，則只會合成此基因之cDNA。
        
        隨機引子是長度為6個鹼基之寡聚核苷酸，但鹼基之種類及順序是隨機組成的，因此隨機引子可黏合至RNA的任一個位置，合成出長度不一之cDNA，
        
        在某些情況下，例如mRNA很長，或是mRNA內部有二級結構，使得cDNA合成效率很差時，就可使用隨機引子來替代其他引子。
  - - - 是一條寡聚核苷酸，兩端各標記不同螢光轉換素，在5端的報告者(reporter)，3端的熄滅者(quencher)，當兩者位於同一條寡聚核苷酸上時，報告者接受刺激後之發光能力會被熄滅者抑制，所發出的螢光波長較長。
      - 5端至3 端外切核酸酶(exonuclease)活性的特殊Taq聚合酶，由引子尾端進行聚合反應，遇到水解探針時，外切核酸酶會水解掉探針，報告者被釋放出來，其發出的螢光能量就不會被熄滅者抑制，發出叫短波之螢光，短波長螢光越強。
      - SYBR Green I
        
        需先設計出不會形成雙引子產物的引子
      - PCR定量
        
        PCR循環中皆可測到螢光值，在同樣的螢光值下，模板的量越少，對應出的循環次數就越多
        
        絕對定量
        
        使用已知濃度之模板做出一條標準曲線
        
        相對定量
        
        比較樣本間的差異
        
        利用兩組樣本同時進行標的基因及參考基因(reference gene)，一般是使用固定表現基因(housekeeping gene)，做為參考基因，其不售實驗處理所影響之PCR
        
        得到個別結果相對值後，再以參考基因進行標的基因校正，則可得到兩組基因的相差倍數
        
        交叉直線(crossing line)
        
        利用不同模板濃度之log值和其交叉直線上的循環次數，可以畫出回歸直線，可作為標準曲線。
        
        要得知未知樣本模板濃度，知道交叉直線那一點所循環的次數，即可推算出樣本之模板濃度
  - - - 雜交探針是兩條以相鄰之方式可和標的片段雜交的寡聚核苷酸，位於5'端之探針的3'尾端標記了一種螢光轉換素(fluorophore)，稱之為給予者(donor)，而位在3'端之探針的5'尾端標記了另一種螢光轉換素，稱之為接受者(acceptor)。
        
        在PCR的過程中，雜交探針可在引子黏合的步驟和標的片段結合，此時就可測量較長波長之螢光量，此螢光量即代表每次PCR循環產生了多少的PCR產物。
        因為雜交探針是特異性地和標的片段結合，因此不似SYBR Green I有偵測到非特異性之PCR產物的缺點。
    - - SYBR Green I會很特異性地和DNA雙股螺旋的小溝(minor groove)結合，在水溶液中，單獨的SYBR Green I只會發出少量背景值螢光，但和DNA結合後會發出很強的螢光，因此在PCR過程中，我們可在每一循環的延展步驟結束時測量代表雙股DNA的螢光強弱，即可知每次PCR循環產生了多少PCR產物。
- - - - 此時要降低溫度，使引子可與序列互補(complementary)的單股模板DNA特異性地黏合。由於每一種引子和模板DNA黏合所需的溫度不同，每對引子均需先測試出一個信號最強，背景值最低之引子黏合溫度，一般是55°C左右。
    - - 以95°C加熱的方式將模板(template)雙股DNA分開。
    - - DNA聚合酶可接著引子3'端進行聚合反應，合成與模板DNA互補的序列，形成新的雙股DNA。一般DNA聚合酶的延展最佳反應溫度是72°C。
    - - 一般一個PCR反應需進行25~30個循環，此種增幅方式是以等比級數增加標的片段的數量，因此理論上來說，只要進行25個循環，可產生之標的片段DNA是106倍於模板DNA 數量。
        
        在前言曾提到因使用熱穩定DNA聚合酶，使得PCR反應可以自動化方式進行。
        
        一般進行PCR反應的機器基本上是一個導熱快速的金屬塊，其上有凹槽，只要將PCR反應所需之試劑全放入管子內，再將管子放入金屬凹槽，設定好實驗者需要的程式後，機器便可自動控制溫度變化及反應時間。
        
        PCR機器最基本的要求是溫度的變化要夠快，到達設定溫度以後，溫度之維持必須要穩定。