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生物技術概論, 10941054A, 10941024A, 10941003A, 10941017A, 10941058A, 10941005A,…

- - - - 這種作用是不需要有另一股作為模板，但是需要有限制酶或其他核酸酵素先將DNA切成3'突端。
  - - - 尚有其他類似的聚合酶，同樣耐熱，且有其他更具優勢的特點。
  - - - 一般常用的反轉錄酶是取材自病毒AMV及MLV，請參考RNA技術。
- - - - 常被用在純化DNA時去除RNA。
  - - - 常被用來定出mRNA轉錄起點的酵素。
- - - - 內切核酸酶(endonuclease)
        
        直接切在DNA中間
        
        EX:限制酶
      - 外切核酸酶(exonuclease)
        
        從DNA的3'端開始一個一個切除
        
        這動作又稱水解(hydrolyze)
      - DNase I-DNA水解酵素 I
        
        最典型的核酸水解酵素，幾乎能將DNA分解，可將DNA完全去除
        
        DNase I蛋白質足跡實驗(DNase I footprinting)
        
        DNA上有蛋白質結合在某些位置的時候，DNase I 的作用會被蛋白質擋住，無法繼續水解，殘留下固定長度的DNA
      - Exonuclease III-DNA外切水解酵素
        
        從雙股DNA上任何缺口開始，將核甘酸從3'往5'一一水解，最後產物為平端
        
        可製作刪減突變株(deletion mutant)
        
        mung bean nuclease
        Bal 31 nuclease
        皆可用來產生刪減突變株
- - - - 有許多特別設計的電腦軟體可以為我們完成
        
        再挑出能切合適位置的限制酶
    - - 考慮
        
        在DNA上出現的頻率不能太高
        
        切成太多片段不易區分出真正要的DNA
    - - 限制酶可能可認四個、限制酶可能可認四個(Haell)、六個(EcoRl)或八個(Notl)甚至更多鹼基對(base pair,簡稱bp)的迴文序列
      - 以或然率計算
        
        每一個位置都會有A、T、C、G四種不同核苷酸出現的可能
        
        六個核苷酸序列
        
        4x4x4x4x4x4=4096個核苷酸序列組合,也就是每種核苷酸組合平均在4096bp才可能會出現一次
        
        出現機率在基因選殖過過程中比較容易利用
        
        從廠商買到的限制酶也是以認識六個核苷酸序列的居多
        
        四個核苷酸序列
        
        4x4x4x4=256
        
        出現太頻繁,DNA被切成太多太小的片段,不太容易運用
        
        八個核苷酸序列
        
        很難出現
      - 對細菌本身而言在限制酶的原始功能上
        
        認六個核苷酸序列
        
        較經濟實惠的自然選擇
        
        來源較多
        
        認四個核苷酸序列
        
        其次
        
        認八個核苷酸序列
        
        極少
      - 認識序列特別的限制酶
        
        並非迴文序列,有時甚至無對稱
        
        認五個鹼基對序列
        
        如Ddel
        
        在某些位置可以是任何一種嘌呤(A、C標示為Pu)或任何一種嘧啶(T、G標示為Py)
        
        四種均可(標示為N)
        
        如Ddel
        
        認奇怪的非迴文序列
        
        如Mboll
    - - 名稱不同
        
        這類酵素被稱為isoschizomer
    - - 限制酶在切開DNA時有一定的對稱切法
      - 認識相同序列的不同限制酶不一定有相同切法
      - 由於序列對稱,無論從哪一股DNA的5'端讀起,切口位置都固定
        
        例2/6表示切口在六個核苷酸中從5'端數起第二個核苷酸的位置
      - 依切口不同分類
        
        平端(blunt end)
        
        突端(sticky end)
        
        5'突端
        
        如EcoRl
        
        3'突端
        
        如Pstl
      - 同一迴文序列可以有五種不同的對稱式限制酶切法
        
        以圖6-2為例
        
        a及b切出的兩類切口端點稱為5'突端
        
        d及e的切口端點稱為3'突端
        
        c的切口為平端
    - - 如果質體只有一個切口
        
        切開的質體便從圓形成為線形(linear)
        
        此步驟稱線形化(linearize)
      - 質體至少要有兩個缺口
        
        才能被分成兩個片段
- - - - 自然界的DNA複製是由5'端往3'端，對於3'突端是沒有可利用的酵素能直接將短缺的5'端缺口從3'端開始補齊，解決辦法是利用T4噬菌體(bacteriophage)的DNA聚合酶將突出的3'端核苷酸修剪成平端。
        
        如圖6-4
      - 雖然T4 DNA聚合酶是將多出的3'突端切除，實際上是先從3'往5'端切除很多核苷酸，再將之補齊至與3'端相當。
      - T4 DNA聚合酶處理DNA常產生錯誤的序列
        
        一定要補充足量的dNTP，否則T4 DNA聚合酶無法正確地完成應有的切除工作。
      - 使用後一定要完全去除活性，否則會影響後續的實驗進行。
      - 兩種酵素同時使用時需要特別注意的地方。
        
        一段DNA片段的兩端分別是5'及3'突端，均需要處理成平端才能繼續下一步的接合工作，此時要依序先以Klenow片段處理，再以T4 DNA聚合酶處理。
    - - 體外突變(in vitro mutagenesis)
        
        利用合成的單股突變寡聚核苷酸作為引子，Klenow片段可以繼續合成質體，而突變的寡核苷酸即成為質體的一部分，便產成帶有突變的質體
      - 合成cDNA（互補DNA）的第二股
        
        當以mRNA當模板，利用反轉錄酶可以作出cDNA，這只是單股的DNA，再利用Klenow片段即可以合成第二股DNA，如此，就得到完整的cDNA
      - 解讀DNA序列(Sequencing DNA)
        
        以適當的引子，用特別標記的dNTP，Klenow片段就能依據模板合成可解讀的序列。
      - 單股探針
        
        在許多的實驗中，會需要用到能與特定DNA或RNA雜交(hybridize)的探針(probe)，利用特別標記的dNTP當原料，Klenow片段即可合成這類探針
      - 補齊
        
        在基因選殖時，將DNA片段5'突端補成平端，以利接合。
      - Random priming
        
        這是另一種標記探針的方法，以隨機組合的六個核苷酸長度的寡聚核苷酸當成引子，即可從DNA的隨機位置開始合成DNA探針
- - - - 圖6-1
      - 兩股DNA是呈互補的，很容易定出一個完整的迴文序列，不一定要寫出全部的雙股序列。