Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
限制酶及其他核酸酵素 - Coggle Diagram
限制酶及其他核酸酵素
6-1限制酶的發現 10941055A
功能
細菌防禦功能
方法
當有其他入侵細菌進入細菌時，限制酶會將外來細菌的質體切斷
目的
確保自己的基因不受汙染
能將雙股DNA切開
方法
將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷，進而於兩條DNA鏈上各產生一個切口，且不破壞核苷酸與鹼基。
發現歷史
1953年被發現於某些品系的大腸桿菌
1970年第一個限制酶Hind II被發現於Heamophilius influenzae，此酵素能切解大腸桿菌的DNA但不會攻擊自身的DNA
來源
來自細菌的酵素
目的
細菌為保護自己的遺傳訊息而演化出的一種專一性酵素蛋白質
應用及發展
基因選殖
全稱
限制性核酸內切酶(restriction enzyme)，又稱限制內切酶或限制性內切酶
類型
第一型
八個鹼基對
核酸序列組胡總類為4^8極難出現，故不常用
第三型
四個鹼基對
平均256bp出現一次，太過頻繁，會將DNA切太碎，故不適用
第二型
六個鹼基對
核酸序列組胡總類為4^6，出現次數剛好，容易在基因選殖中利用
6-7與RNA有關的核酸水解酵素10941038A
2.RNase A :是一種核糖核酸酶(endoribonuclease)，切在單股RNA中嘧啶的3'端，作用在RNA-DNA或RNA-RNA中露出的單股RNA，因此可以把RNA切碎、分解，常被利用在純化DNA時去除RNA。
RNase T1:類似RNase A的作用，切在G位置的3'端，同樣能將RNA切碎。
S1 nuclease:認識RNA-DNA，將其中比RNA 5'端長出的DNA部分水解，可以定出5' RNA相對應的DNA序列位置，常被用來定出mRNA轉錄起點的酵素。
4.RNase H:認識DNA-RNA雜交物，將其中的RNA部分水解。通常在反轉綠病毒中，RNase H 是與反轉錄酶在一起，當反轉錄病毒以RNA做模板，反轉錄出DNA之後，RNase H 就負責分解原來的RNA。他不會切單股的核酸、雙股DNA及雙股RNA，因此在以mRNA為模板合成第一股cDNA後，可以利用此酵素將mRNA去除，以便繼續合成第二股cDNA。
6-5其他核酸聚合酶
Taq DNA Polymerase 10941055A
應用
聚合酶連鎖反應(PCR)
目的
放大短DNA片段表現
優點
耐熱、反應快
缺點
容易出錯
特性
耐熱
來源
錢嘉韻於1976年從嗜熱細菌海棲熱袍菌（Thermus aquaticus）中分離出的DNA聚合酶
命名
Thermus aquaticus polymerase
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT) 末端脫氧核苷酸轉移酶 10941060A
是一種特殊的DNA聚合酶
顯示出未成熟的、"前B"，"前T淋巴細胞"和"急性淋巴性白血病/淋巴瘤細胞"。
"末端轉移酶"於"抗體基因重組時"加上N核苷酸（N-nucleotide）至V(D)J的外顯子上，能夠形成連接多樣性（Junctional diversity）的現象。
在人類中，末端轉移酶是由DNTT基因來編碼。
TdT不存在於"胎肝造血幹細胞"上，而在胎兒期明顯的損害B細胞之連接多樣性。
"末端轉移酶"催化添加核苷酸至DNA分子的3'末端的反應。不像大多數的DNA聚合酶，它不需要一個模板。
這種酶的優選底物是3'突出端，但它也可以添加"核苷酸"(nucleotides)至"鈍末端"(blunt end)或"凹陷的3'末端"(recessed 3' end)
鈷是一種必要的輔因子，但是在"體外"反應條件下(in vitro)鎂(Mg)及錳(Mn)也可以起相同的作用。
應用
它可以被用來在快速擴增cDNA末端(RACE)中來添加"核苷酸"(nucleotide)，然後可以用來作為在後續PCR的"引物"(primer)的模板。
可以用於添加標記放射性同位素的核苷酸，例如在TUNEL檢測(末端脫氧核苷酸轉移酶"dUTP缺口末端標記"(dUTP Nick End Labeling))，用於細胞凋亡的示範(其中的標記，在某種程度上，通過片段化DNA來進行)
可用於治療"急性淋巴性白血病"診斷之"免疫熒光測定"(immuno-fluorescence)。
T7 RNA Polymerase & T3 RNA Polymerase
常被利用為體外轉錄系統
分別從不同的是菌體中純化出的RNA聚合酶
提供正確的轉錄子以轉錄出下游的RNA
合成適當的轉錄產物
6-6具有外切酶功能的核酸水解酵素
Exonuclease III-DNA外切水解酵素III 10941008a
方式
從雙股DNA上任何缺口（nick）處
將核苷酸從3'往5'段水解
應用
刪刪減突變珠(deletion mutant)
相似物
mung bean nuclease
Bal 31 nuclease
DNase Ⅰ - DNA水解酵素10941038A
最典型的核酸水解酵素，幾乎能將DNA完全分解。
若DNA上有蛋白質結合在某些位置時，DNase I的作用就會被蛋白質阻擋，不能再繼續水解，殘留下固定長度的DNA。
6-4 切口修飾酵素
T4 DNA聚合酶 (T4 DNA Polymerase) 10941025A
自然界的DNA複製是由5'端往3'端，因此對於3'突端是沒有可利用的酵素能直接將短缺的5'端缺口從3'端開始補齊
利用T4噬菌體(bacteriophage)的DNA聚合酶將突出的3'端核苷酸修剪成平端
T4 DNA聚合酶是將多出的3'突端切除，但此酵素的作用機制實際上是先從3'往5'端切除很多核苷酸，再將之補齊至與3'端相當。此時，一定要補充足量的dNTP。
否則T4 DNA聚合酶無法正確地完成應有的切除工作，這也是以T4 DNA聚合酶處理DNA常產生錯誤的序列，無法得到預期產物的原因。
Klenow片段
對於5'端利用Klenow片段補齊
利用5'端作為模板
在短缺的3'端加上互補的核甘酸
5'端補城平端 保留住原本的5'突端序列
須提供製作DNA的原料
dNTP
dCTP
dTTP
dATP
dGTP
用途
補齊
基因選殖時將5'端補承平端以利接合
接獨DNA序列
以適當的引子 用特別標記的dNTP 就能依據模板合成可解毒的序
體外突變
利用合成的單股突變寡聚合甘酸嘬文引子
klenow片段可以繼續合成質體
突變的寡核甘酸即成為質體的一部分
合成cDNA
以mRNA當模板 利用反轉錄酶做出cDNA
形形成單股DNA需利用Klenow片段合成第二股DNA
單股探針
Klenow片段可合成
Random priming
以隨機組合的六個核甘酸長度的寡具核甘酸當成引子
6-2限制酶的命名 10941060A
根據取材來源的菌種學名縮寫而來
1屬 2種 3品系 4在此類細菌中發現的順序
6-3限制酶選用
限制酶
用途
實驗中需要很長的DNA序列
先找出各種限制酶的位置
再用電腦軟體將想要的片段切割出來
可以辨認的鹼基對數目
限制酶在DNA上的頻率不能太高
6個鹼基對(EcoRl)共4096種核甘酸序列組合，由於較為經濟實惠，因此最常見
8個鹼基對(Notl)共65536種核甘酸組合
4個鹼基對(Haelll)同種核甘酸會出現太頻繁
有時，不同菌種可以純化出任是相同序列的限制酶，這類限制酶被稱為isoschizomer
鹼基對序列名稱
任何一種嘧啶(T、G標示為Py)
四種均可的標示為N
任何一種嘌呤(A、C標示為Pu)
非迴文序列(如Mboll)
認五個鹼基對序列(Ddel)
切法
切口端皆為平端(blunt end)
切口端皆為突端(sticky end)
切口端皆為3'端(Pstl)
切口端皆為5'端(EcoRl)
只有一個切口
質體從圓形變成線型(線型化linearize)
細菌為何不會切割自己的DNA?
有特殊酵素可以修飾自己的DNA
將A或G的位置甲基化(methylation)
