生技概論 第六章 限制酶及其他核酸酵素
6–3 限制酶的運用(10941050A)
實驗情況
找出限制酶位置
選擇的限制酶在DNA出現頻率不能太高
否則
切成太多片段
不容易從多個片段中區分出真正想要的DNA
限制酶(以或然率計算)
4個(HaeIII)=4e4 (出現太頻繁，DNA被切的太小不易利用
6個(EcoRI)-最常使用
8個(NotI)-很難出現
更多bp的迴文序列
每個位置有四種(ATCG)的可能=4e6=4096(組合平均為4096bp)-較易利用
從不同菌種可以純化出認識相同序列的限制酶(但名稱不同)稱為isoschizomer
有對稱
無對稱
迴文序列的限制酶
限制酶在切開DNA時會有一定的對稱切法
相同序列的不同限制酶不一定有相同切法
序列是對稱的(無論從哪裡讀起切口都是固定位置)
例子
2/6表示切口在6個核甘酸中從5'端數起的第二個核苷酸的位置
切口
平端(blunt end)
突端(sticky end)
3'突端(PstI)
圖片
6-5其他核酸聚合酶(10941031A)
5'突端(EcoRI)
如果質體只有一個切口，被切開的質體會從圓形變成線行(linear)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)
T7 RNA Polymerase及
T3 RNA Polymerase
Taq DNA Polymerase
Reverse Transcriptase（反轉錄酶）
統稱線形化(linearize)
6-7 與RNA有關的核酸水解酵素(10941004A)
介紹
某些核酸水解酵素是分解RNA，或是認識DNA-RNA雜交物，不同實驗會利用到
S1 nuclease
RNase A
RNase T1
RNase H
水解步驟
將其中比RNA5’端長出的DNA部分水解
訂出5’RNA相對應的DNA序列位置
認識RNA-DNA
常被用來訂出mRNA轉錄起點的酵素
質體至少要有兩個缺口才能被分成兩個片段
是一種核糖核酸酶
切在單股RNA中嘧啶的3’端
作用在RNA-DNA或RNA-DNA中露出的單股RNA
因此可以把RNA切碎、分解
常用在純化DNA時去除RNA
功用
類似RNase A 的作用
切在G位置的3’端，也能將RNA切碎
主要是細菌用來切除外來質體保護自己的工具
認識DNA-RNA雜交物，將其中的RNA部分水解
通常在反轉錄病毒中，RNase H 是與反轉錄酶在一起
當反轉錄病毒以RNA作模板，反轉錄出DNA
反轉錄出DNA後，RHase H 就負責分解原來的RNA
不會切單股核酸、雙股DNA和雙股RNA
以mRNA為模板合成第一股cDNA後，可以利用此酵素將mRNA去除，以便繼續合成第二股cDNA
原理
細菌有種酵素可以修飾自己的DNA，把A或G的位置甲基化(methylation)
介紹
只要提供正確的啟動子，這些聚合酶便可轉錄出下游的RNA，常被利用為體外轉錄(in vitro transcription)系統，以合成適當的轉錄產物。
細菌可以辨識DNA甲基化的模式
分別從不同噬菌體中純化出的的RNA聚合酶
相同
不同
不會被細菌的限制酶分解
會被細菌的限制酶分解
功用
介紹
功用
介紹
功用
在PCR (polymerase chain reaction)中使用的聚合酶
這種聚合酶是從硫磺中的細菌中純化出來的，由於它的耐熱性，可以在DNA加熱至95ºC變性以便分開雙股螺旋時，仍具有相當活性，因此DNA模板可以不斷再被引子黏合，反覆這種連續性的聚合反應。
1.標記DNA的3'端
2.加上單種核苷酸長串供黏合用
這種聚合酶可以在任何單股DNA突出的3'端連續加上10~40個長串單種核苷酸
介紹
此酵素可以DNA為模板，反轉錄出DNA
這是許多RNA病毒都具有的酵素，一般常用的反轉錄酶是取材自病毒AMV及MLV。
6-4 切口修飾酵素(10941018A、10941036A)
Klenow 片段( Klenow Fragment)
T4 DNA聚合酶 (T4 DNA Polymerase)
原理
利用5'突端作為模板，在短缺的3'端加上互補的核苷酸，而將5'突端補成平端，保留住原本的5'突端序列
製作DNA的原料dNTP
dATP、dCTP、dTTP及dGTP
相關技術
- 解讀DNA序列(Sequencing DNA)
- 體外突變(in vitro mutagenesis)
- 補齊
- 合成cDNA（互補DNA）的第二股
- 單股探針
- Random priming
原理
利用T4噬菌體(bacteriophage)的DNA聚合酶將突出的3'端核苷酸修剪成平端
在基因選殖時，將DNA片段5'突端補成平端，以利接合。
以適當的引子，用特別標記的dNTP，Klenow片段就能依據模板合成可解讀的序列。
利用合成的單股突變寡聚核苷酸作為引子，Klenow片段可以繼續合成質體，而突變的寡核苷酸即成為質體的一部分，便產生帶有突變的質體。
當以mRNA當模板，利用反轉錄酶可以作出cDNA，再利用Klenow片段即可以合成第二股DNA
利用特別標記的dNTP當原料，Klenow片段即可合成這類探針。
這以隨機組合的六個核苷酸長度的寡聚核苷酸當成引子，即可從DNA的隨機位置開始合成DNA探針。
重要機制
6-1限制酶的發現 10941028A
介紹
來自細菌的一類酵素
細菌為了保護自己的遺傳訊息，而演化出之一種能認識特定DNA序列的酵素蛋白質
1953年
發現不同的大腸桿菌品系之間在傳遞DNA時，外來的DNA在細菌體內並不會被完全分解，而是被切成片段
有某種特別的酵素存在，可以切斷外來質體，防止已入侵質體在細菌體內任意複製，有了這種防禦機制才能確保自己的基因體不受其他細菌DNA所污染
1970年
找到答案，才真正從Haemophilus influenzae細菌中純化出第一個限制酶HindII出來
成功地證實它的確可以將萃取出來的大腸桿菌DNA切成片段，卻不會切來自於Haemophilus influenzae本身的DNA
結果
其他各式各樣能修飾或改造核酸片段的酵素也一一被發現，並且廣泛應用在基因工程技術或生化技術上
可以從DNA中切割出想要研究的部分片段
先從3'往5'端切除很多核苷酸，再將之補齊至與3'端相當(此時一定要補充足量的dNTP)
注意事項(兩種酵素同時使用時)
兩種酵素使用完後皆須將其去除活性
如果一段DNA片段的兩端分別是5'及3'突端，均需要處理成平端才能繼續接合工作，且要依序先以Klenow片段處理，再以T4 DNA聚合酶處理
圖示
圖示
6-6具有外切酶功能的核酸水解酵素(10941044A)
核酸水解酶(nuclease)
依作用的位置不同
能切DNA或RNA的酵素
內切核酸酶(endonuclease)
外切核酸酶(exonuclease)
限制酶
從DNA的3'端開始將核苷酸一個一個切除，這種動作又稱為水解(hydrolyze)，大部分的核酸水解酶都是如此作用的
DNase I－DNA水解酵素I
當DNA上有蛋白質結合在某些位置時，DNase I的作用就會被蛋白質阻擋不能再繼續水解，殘留下固定長度的DNA
最典型的核酸水解酵素
幾乎能將DNA完全分解，若某些實驗中必須完全除去DNA，就會利用到它
DNase I蛋白質足跡實驗(DNase I footprinting)技術的原理
6-2 限制酶的命名(10941053A)
根據取材來源的菌種學名縮寫而來
例
EcoRI酵素的名稱
Eco表示大腸桿菌(E. coli)
R代表從RY13品系(strain)中純化出的
I表示第一種限制酶
限制酶之所以被稱為限制酶，意思是每一種酵素只認識某種限定的DNA
大部分的限制酶都是認識特別的對稱序列，稱作迴文序列(palindrome)
兩股DNA是呈互補的，也就是A對T，C對G
只要利用上面那股的起始三個ATG核苷酸序列，就可以知道另外一股是與它們互補的TAC
如果再仔細看看這樣的序列，又會發現對單股DNA而言，序列是頭尾互補的
因此，也很容易從單股DNA序列中找出迴文序列，不一定要寫出全部的雙股序列。