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第6章 - Coggle Diagram
第6章
限制酶的選用10812060A
迴文序列限制脢
『六個』鹼基對最常用
介紹
認識相同序列的不同限制酶不一定有相同切法
序列是對稱，切口是固定位置
切開DNA有一定對稱切法
切口形狀
突端
平端
非迴文序列限制脢
序列無對稱可言
isoschizomer:從不同菌種純化出相同序列但
不同名稱的限制酶
適當限制酶在DNA上出現的頻率不能太高
細菌把A、Ｇ甲基化
限制酶不能切細菌自身DNA
6-1 限制酶的發現10941002A
限制酶
來自細菌
酵素
細菌保護自己的遺傳訊息
認識特定DNA序列
酵素蛋白質
切斷外來的質體
防止已入侵的質體在細菌體內任意複製
確保自己的基因體度不受其他DNA汙染
Haemophilus influenzae細菌
純化出第一個限制酶Hindll
將萃取出來的大腸桿菌DNA切成片段
不會切來自於Haemophilus influenzae本身的DNA
保護自己原本的染色體不受限制酶作用
200種以上的限制酶被商品化
實驗室自行純化限制酶
來源普遍性
扮演重要角色
修飾改造核酸片段
廣泛應用在生物基因技術或生化技術
6-7與RNA有關的核酸水解酵素
10941007A
RNase A
是一種核糖核酸酶（endoribonuclease) ，切
在單股RNA中嘧啶的3' 段，作用在RNA-DNA或
RNA-RNA中露出的單股RNA，因此可以把RNA
切碎、分解，常被用在純化DNA時去除RNA
RNase T1
類似rnase A的作用，切在G位
置的3' 段，同樣能將RNA切碎
S1 nuclease
認識RNA-DNA，將RNA 5'端長出的DNA部
分水解，可以定出5' RNA相對應的DNA序列
位置，常被用來定出mRNA 轉錄起點的酵素
RNase H
認識DNA-RNA雜交物，將RNA部分水解。通常
在反轉錄病毒中，RNase H是與反轉錄酶在一
起，當反轉錄病毒以RNA作模板，反轉錄出DNA
之後，RNase H就負責分解原來的RNA。它不會
切單股的核酸、雙股DNA及雙股RNA，因此在以
mRNA 為模板合成第一股cDNA後，可以利用此
酵素將mRNA去除，以便繼續合成第二股cDNA
6-5 其他核酸聚合酶
10941022A
Taq DNA Polymerase
由於它的耐熱性可以在DNA加熱至95ºC變性以便分開雙股螺旋時，仍具有相當活性
因此DNA模板可以不斷再被引子黏合，反覆這種連續性的聚合反應
尚有其他類似的聚合酶同樣耐熱且有其他更具優勢的特點
這種聚合酶是從硫磺的細菌中純化出來的，也就是在PCR (polymerase chain reaction)中使用的聚合酶
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)
這種聚合酶可在任何單股DNA突出的3'端連續加上10~40個長串單種核苷酸，常用在標記DNA的3'端，或加上單種核苷酸長串供黏合用
這種作用不需有另一股作為模板，但是需有限制酶或其他核酸酵素先將DNA切成3'突端
T7 RNA Polymerase及T3 RNA Polymerase
這是分別從不同的噬菌體中純化出的RNA聚合酶
只要提供正確的啟動子，這些聚合酶便可轉錄出下游的RNA，常被利用為體外轉錄(in vitro transcription)系統，以合成適當的轉錄產物
Reverse Transcriptase（反轉錄酶）
此酵素可用DNA為模板，反轉錄DNA這是許多RNA病毒都具有的酵素
由於它的獨特性完全不同於傳統的DNA → RNA的觀念，反而提供生物學家一個有用的利器，利用這種特性以mRNA為模板反轉錄出cDNA。
一般常用的反轉錄酶是取材自病毒AMV及MLV
6-2限制酶命名10941011A
命名
菌種學名縮寫而來
為何稱限制酶
酵素中只認識某種限定DNA，大部分為對稱序列(迴文序列)
正讀反讀都相同( 5'端到3'端)
特性
上下從5'端到3'端，兩股DNA序列呈互補
單股，頭尾互補(第一二三個核苷酸和倒數一二三核苷酸互補)
6-4 切口修飾酵素(10941049A、10941026A)
Klenow片段 (Klenow Fragment)
利用5'突端作為模板，在短缺的3'端加上互補的核苷酸，而將5'突端補成平端，保留住原本的5'突端序列
在反應進行時，一定要提供製作DNA的原料dNTP，也就是dATP、dCTP、dTTP及dGTP
相關技術
體外突變
(in vitro mutagenesis)
利用合成的單股突變寡聚核苷酸作為引子，Klenow片段可以繼續合成質體，而突變的寡核苷酸即成為質體的一部分，便產成帶有突變的質體。
合成cDNA（互補DNA）的第二股
當以mRNA當模板，利用反轉錄酶可以作出cDNA，這只是單股的DNA，再利用Klenow片段合成第二股DNA。
解讀DNA序列(Sequencing DNA)
以適當的引子，用特別標記的dNTP，Klenow片段就能依據模板合成可解讀的序列。
單股探針
在許多的實驗中，會需要用到能與特定DNA或RNA
雜交
(hybridize)的
探針
(probe)，利用特別標記的dNTP當原料，Klenow片段即可合成這類探針。
補齊
在基因選殖時，將DNA片段5'突端補成平端，以利接合
Random priming
以隨機組合的六個核苷酸長度的寡聚核苷酸當成引子，即可從DNA的隨機位置開始合成DNA探針
T4 DNA聚合酶 (T4 DNA Polymerase)
由於自然界的DNA複製是由5'端往3'端，因此對於3'突端是沒有可利用的酵素能直接將短缺的5'端缺口從3'端開始補齊，在這種情況下，解決辦法是利用T4噬菌體(bacteriophage)的DNA聚合酶將突出的3'端核苷酸修剪成平端
6-6具有外切酶功能的核酸水解酵素10941045A
能切DNA或RNA的酵素
外切核酸酶
從DNA的3'端開始將核甘酸一個一個切除，
此動作又稱水解
DNase I-DNA水解酵素I
當DNA上有蛋白質結合在某些位置時，DNase I的作用就會被蛋白質阻擋，不能再繼續水解，殘留下定長度的DNA。這也就是DNA I蛋白質足跡實驗技術的原理
Exonuclease III-DNA外切水解酵素III
從雙股DNA上任何缺口處開始，將和甘酸從3'端往5'端一一水解，最後的產物是平端，一作用時間長短而產生不同長度的DNA片段。在製作一系列不同長度的刪減突變株時，十分有用。
內切核酸酶
直接切在
DNA
的中間
