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Laboratorio de Biología Molecular, Electroforesis de ADN, PCR: reacción en…

- - - - Equipo
        
        Cámara horizontal de electroforesis
        
        Fuente de alimentación o de poder
        
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        Material
        
        Micropipetas • Puntas para micropipeta • Tubos tipo eppendorf 34 Herramientas moleculares aplicadas en ecología • Un matraz, probetas y vasos de precipitados para la preparación de soluciones • Espátulas • Guantes impermeables para el manejo del bromuro de etidio
        
        Reactivos
        
        -Agarosa - Tris bas - Ácido acético glacial - EDTA - Ácido bórico - NaOH - Sacarosa - Glicerol -Azul de bromofenol -Xileno cianol -Bromuro de etidio
        
        Soluciones y buffers
        
        Buffer TAE (50x) 1 L
        
        Buffer TBE (5x) 1 L
        
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        Método
        
        Preparación del gel de agarosa
        
        Preparación de las muestras
        
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  - - - como afectan
        diferentes parámetros al rango de separación en la PFGE, tomando como referencia el sistema CHEF
        
        Tiempo de pulsos
        
        Es el parámetro clave que determinará el rango de tamaños
        que se puedan separar en una electroforesis PFGE.
        
        Intensidad de campo
        
        Moléculas de ADN de hasta 2 Mb de tamaño
        pueden separase con voltajes de 4-6 V/cm. Mayor tamaño mayor voltaje.
        
        Tiempo total de electroforesis
        
        Cuanto más grandes son los tamaños a separar se requieren voltajes
        más bajos, y como consecuencia tiempos más largos
        
        Concentración de agarosa
        
        este parámetro es crucial para separar distintos rangos de tamaños, en la PFGE
        su importancia no es tan grande. Tamaños mayores de ADN requerirán concentraciones de agarosa más bajas.
        
        Temperatura.
        
        tiene que estar refrigerado entre
        4-15°C
  - - - se usan para separar fragmentos de ADN monocatenario, y se utilizan en técnicas como la secuenciación, DGGE o extensión del primer
- - - - Es una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética
        
        La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne
        
        Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN
        
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        Mediante la electroforesis en gel de agarosa, Thorne logró separar y visualizar tres formas topológicas diferentes del ADN del polyomavirus:
        
        superenrrollada, relajada y lineal
        
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- - - - La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución
        
        tienen un poder de resolución mucho menor, el rango de tamaños
        que pueden separarse es mucho mayor en un gel de agarosa
        
        cuanto más baja es la concentración de agarosa mayor es
        el tamaño de las moléculas que pueden separarse, y viceversa
        
        tiene un límite superior de unas 40-50
        kb en el tamaño de las moléculas de ADN que puede separar
        
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      - la electroforesis en geles de poliacrilamida, tiene una mayor limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un sólo par de bases.
        
        se corren de forma vertical y tienen la desventaja de ser
        más complicados en su elaboración y manipulación.
- - - - tienen incorporado un software
        que permite guardar fotografías del gel en formatos como TIFF, JPG
- - - - cada una de las tres técnicas que se describen en este
        capítulo tiene aplicaciones específicas que se indican a continuación:
        
        Las técnicas de electroforesis de ADN
        
        Se utiliza además muy
        frecuentemente para la realización de mapas de restricción,
        
        La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)
        
        tiene como objetivo la
        separación de fragmentos de ADN de tamaño elevado.
        
        La electroforesis de ADN en gel de poliacrilamida no desnaturalizante
        
        pero se utiliza para la separación de fragmentos más pequeños y cuando se quiere obtener una mayor resolución
- - - - se han encontrado al menos 12 proteínas involucradas
        
        actúan en diferentes actividades,
        
        La síntesis de nuevas cadenas de ADN
        
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- - - - en 1983
        
        cuando Kary Mullis y sus compañeros de la compañía californiana Cetus Corporation la llevaron a cabo por primera
        
        usaron dos iniciadores que se alineaban con cada una de las hebras del ADN, adicionaron ADN polimerasa I de Escherichia coli y nucleótidos trifosfatados
        
        En un principio, para llevar a cabo el ciclo de PCR, se calentaba la mezcla en baño María, pero cuando llegaba a más de 90 ºC
        
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- - - - Amplificación
        
        • Desnaturalización inicial • Ciclos de la PCR: desnaturalización, alineamiento y extensión • Extensión final
        
        Electroforesis