Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
DNA-technologie: PCR 3 - Coggle Diagram
DNA-technologie: PCR 3
specificiteit bewaken
fragmenten komen specifiek overeen met de gezochte target
nested PCR
proces
PCR fragment v.d. eerste reactie met de outer primer wordt na de reactie uit de gel geïsoleerd
uit gel elueren of verdunning (1/100)
eerste amplificatie is niet 100% specifiek
verhogen v.d. specificiteit en de sensitiviteit
touch down
proces
eerste annealing met aantal °C boven de annealingtemperatuur
verder in cyclus: 1à 2 graden verlagen =>
primer niet dimeren
geen aspecifieke producten
beperkt #aplicons in een complexe genomische context
gewenst #aplicons opgehoopt => normaal stringent PCR-protocol
verhogen van opbrengst en de specificiteit
hotstart
mismatchen
wanneer?
tijdens opwarmen v.d. reactie
tijdens pipeteren van reactiemengsel
wat?
bekomen van specifiek fragmentje = fragment met primer erin
tweede primer bindt en verlengt + pimerset amplificeren
primer bindt aan enkelstrengig DNA en wordt verlengt door DNA polymerase
opl.?
3'-geblokkeerde dNTP's geactiveerd door hittebehandeling
niet alle componenten bij de start samen toedienen
waslaagje bovenop PCR-mix waar boven DNA polymerase bevindt, smelt bij 70°C
manueel: DNA denatureren en enzym toevoegen op moment dat de reactie daalde is tot bv. 80°C
initiële opwarming:95°C
sensitiviteit
= geen fout negatieve resultaten
% vals negatieven
specificiteit
= positieve uitslag uitsluitend wordt gevonden wanneer een target effectief aanwezig is
% vals positieven
multiplex PCR
def.?
meer dan 2 primers in 1 reactievatje samenbrengen
hetzelfde template DNA meerdere reacties laten uitvoeren
voorwaarden?
geen onderlinge interactie v.d. primers (dimeervorming)
dezelfde annealingtemperatuur
voldoende variatie in fragmenten lengete
RT-PCR = Reverse Transcriptase PCR
waarom?
aanwezigheid van bepaalde gebieden in mRNA
genexpressie bekijken
hoe?
two-step RT-PCR
= afzonderlijk cDNA aanmaken + PCR uitvoeren in een apart experiment
proces
denatratie van RNA
synthese cDNA
primers
voor generen van dubbelstrengig structuur met vrij 3'-OH uiteinde
mogelijkheden
cDNA
3' poly-A
oligo-dT primers
RNA
geen poly-A
random primers
(viraal) reverse transcriptase door bv. enzym: MMLV (Moloney murine leukemia virus)
voordeel
verschillende genen testen
one-step RT-PCR
=cDNA synthese vindt plaats in dezelfde reactie als PCR
voordelen
minder manipulaties vereist
tijdswinst
reverse transcriptase
o.b.v. v.d. specifieke primers die ook voor PCR dienen
manieren
klassiek bijgevoegd aan PCR
Tth DNA polymerase + Mn2+ ionen
mRNA => cDNA
cDNA synthese voor PCR
specifieke reverse primer
random primers (hexnucleotiden)
oligio dT