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Ch6限制酶及其他核酸酵素 - Coggle Diagram

- - - - 體外突變：用有突變的寡聚合甘酸當作引子，製作另一股質體
      - 解讀DNA序列
      - 補齊：將5'凸端補承平端，以利接合
      - 合成cDNA：以mRNA當模板，加反轉錄酶和成單股DNA，再加Klenow Fragment合成第二股DNA
      - 單股探針：以標記的dNTP當原料，合成探針
      - Random priming：以隨機組合且長度為六個核甘酸長度的寡聚合甘酸當引子，從DNA的隨機位置開始合成DNA探針
  - - - 補充足量的dNTP
      - 使用後完全去除活性
      - 若DNA兩多分別是5'及3'凸端，先以Klenow處理5'凸端，再以T4 DNA處理3'凸端
- - - - 限制酶是一種典型的內切核酸酶(endonuclease)代表，也就是直接切在DNA的中間
    - - 外切核酸酶(exonuclease)則是從DNA的3'端開始將核苷酸一個一個切除，這種動作又稱為水解(hydrolyze)，大部分的核酸水解酶都是如此作用
        
        DNase I－DNA水解酵素I
        
        最典型的核酸水解酵素，幾乎能將DNA完全分解，此外，當DNA上有蛋白質結合在某些位置時，DNase I 的作用就會被蛋白質阻擋，不能再繼續水解，殘留下固定長度的DNA。這也就是DNase I 蛋白質足跡實驗(DNase I footprinting)技術的原理
        
        蛋白質足跡實驗
        
        將欲分析的DNA片段端點標記，在加入特定蛋白質後，只要DNA上有此蛋白質認識的DNA結合位置(DNA binding sites)，蛋白質即會坐在該處，當以DNase I 或其他化學方式進行DNA切解時，該處的DNA被蛋白質保護住，不會被切到，因此得不到該特定長度的產物。在與未加入蛋白質的對照樣本比較之後，即可得知蛋白質保護區也就是蛋白質與DNA結合的區域
        
        Exonulease III－DNA外切水解酶酵素III
        
        其會從雙股DNA上任何缺口(nick)處開始，將核苷酸從3'端往5'端一一分解，最後的產物是平端，會依作用時間長短而產生不同長度的DNA片段。
        
        在製作一系列不同長度的刪減突變株(deletion mutant)時，十分有用。其他有類似功能的尚有mung bean nuclease 及 Bal 31 nuclease 也都可以用來產生刪減突變株
- - - - 通常限制酶可能可以認四個（表6-1中的HaeIII）、六個(EcoRI)或八個(NotI)甚至更多鹼基對（base pair，簡稱bp）的迴文序列，但在實際應用價值上，還是以認六個鹼基對的限制酶最常使用。
      - 因為以或然率來計算，在每一個位置都會有A、T、C、G四種不同的核苷酸出現的可能，所以六個核苷酸的序列組合總類是4×4×4×4×4×4＝46＝4096個核苷酸序列組合，也就是說每種核苷酸組合平均在4096 bp，才可能會出現一次，這樣的出現機率在基因選殖的過程中比較容易利用，四個核苷酸的序列則是4×4×4×4＝256，因為出現太頻繁，DNA可能切成許多太小太碎的片段，不太容易利用；而八個核苷酸的序列則很難出現。
        
        同樣的，可以從廠商買到的限制酶也是以認識六個核苷酸序列的居多，對細菌本身而言在限制酶的原始功能上，認識六個核苷酸序列也是較為經濟實惠的自然選擇，因此來源較多。認四個核苷酸序列的其次，八個的極少。
        有些時候，從不同的菌種可以純化出認識相同序列的限制酶，但名稱不同，這類酵素被稱為isoschizomer。
      - 另外有一些限制酶，認識的序列較特別，並非迴文序列，有時甚至無對稱可言，
        如表6-1中所舉的例子：認五個鹼基對序列的（如DdeI）；或是在某些位置可以是任何一種嘌呤（A、C標示為Pu）或任何一種嘧啶（T、G標示為Py）；甚至四種均可的（標示成N，如DdeI）；有些還可以認奇奇怪怪的非迴文序列（如MboII）。
    - - 限制酶在切開DNA時會有一定的對稱切法。
        
        認識相同序列的不同限制酶不一定有相同的切法，例如圖6-2所示。
        
        由於序列是對稱的，所以無論是從哪一股DNA的5'端讀起，切口都是固定的位置。
        
        例如2/6表示切口在六個核苷酸中從5'端數起第二個核苷酸的位置。
        
        根據切口的不同，可分成兩大類：一類稱作平端(blunt end)，如圖6-2(c)；一類稱作突端(sticky end)，而突端又可分成5'突端如EcoRI，或3'突端如PstI，參考表6-1及圖6-2。
        
        如果質體只有一個切口，切開的質體便從圓形成為線形(linear)，這個步驟一般稱為線形化(linearize)。
        質體至少要有兩個切口，才能被分成兩個片段。
        
        在最開始我們提過，限制酶主要是細菌用來切除外來的質體，保護自己基因體的工具，那麼細菌為什麼不會切自己的DNA呢？
        
        這是因為細菌有一種酵素可以修飾自己的DNA，把A或G的位置甲基化(methylation)，
        
        每種細菌的甲基化模式不同，細菌可以辨識，若DNA的甲基化模式和自己的相似，這個DNA即具有免疫力，不會被此細菌的限制酶攻擊，反之，DNA就會被分解。