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Electroforesis y PCR
La electroforesis en geles de agarosa es una de las metodologías mas utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo de ácidos nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra teniendo un estimación de su concentración y grado de entereza
Si se fuerza a los ácidos nucleicos a través de un gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará que las moléculas de mayor tamaño migren con mas lentitud, mientras las de menor tamaño avanzan mas en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función a su tamaño.
La electroforesis en geles de de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en cuanto al tamaño de los fragmentos que podemos separar {5-600} posee un poder de resolución mucho mayor, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un solo par de bases.
Se corren de manera vertical y tienen las desventaja de ser mas complicados en su elaboración y manipulación.
Los geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho menor que los poliacrilamida, porque no permite separar moléculas de ADN que difieren en tamaño de unas 50 pb. Sin embargo, el rango de tamaños que pueden separarse es mucho mayor en un gel de agarosa.
Los geles de agarosa convencionales se corren una cámara de electroforesis horizontal con un campo eléctrico uniforme y constante.
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PCR
La reacción en cadena e la polimerasa, es una técnica importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a partir de una sola molécula.
La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de DNA a partir de otra la cual funciona como molde.
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Etapas de la técnica
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Durante el PCR: Preparación de la muestra, amplificación, desnaturalización inicial, ciclos de la PCR: desnaturalización, alineamiento y extensión, extensión final.
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Etapas de la técnica
-Obtención de las muestras de ADN
-Preparación del gel de agarosa
-Preparación de las muestras con el buffer de carga
-Carga de las muestras
-Corrida del gel
-Teñido del gel
-Visualización del gel con luz ultravioleta y análisis de resultados
La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes. Las cadenas de polímero de agarosa forman fibras helicoidales que al solidificar forma una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y > 200 nm.
La agarosa estándar se disuelve en buffer a una temperatura de 90-95°C y solidifican a 35-45°C. Las agarosas de bajo punto de fusión se disuelven a unos 65°C y solidifican a 30-35°C. Las agarosas de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad que permiten respectivamente una mejor separación y un rango inferior del tamaño de las moléculas a separar.
Equipo
Cámara horizontal de electroforesis
fuente de poder
Transiluminador
equipo fotográfico que permita tomar fotos del gel
Material
Micropipetas
Puntas para micropipetas
Tubo tipo eppendorf
Un matraz, probetas y vasos de precipitados para la preparación de soluciones
Espatulas
Guantes impermeable para el manejo de bromuro de etidio
Reactivos
Soluciones y buffers
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Método
- Preparación del gel de agarosa
- Preparación de las muestras
3.Carga de las muestras y corrida del gel
- tinción del gel y visualizaci6n del ADN
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