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生物技術概論, 10941024A, 10941003A, 10941017A, 10941054A , 10941037A, 10941005A,…

- - - - 一種能提高細菌吃入DNA能力的方式來進行細菌轉型
      - 細菌經由連續的低張溶液處理，與DNA混合後，接上電極，經由瞬間電流使細胞膜暫時通透
      - 可以讓80%的細菌具有轉型能力，幾乎可以達到109／mgDNA的轉型效率，意思是每mg DNA可讓109個細菌產生轉型。
      - 非常有效且可靠的方法，但機器設備較為昂貴，用途廣泛
    - - 古老而傳統的方式，大約每mg DNA可以讓107個細菌得到質體。
      - 經由CaCl2連續處理過的細菌，它的細胞膜會因CaCl2而通透性增加，也就是說產生了一些開口，當DNA與其混合後，以短時間的瞬間熱處理，DNA就會被細菌吃入。
      - 便宜簡單的常用方法，並不因為方法老舊而被淘汰。
  - - - 一種不具病原性的桿菌，常利用在工業用途，用以產生抗生素、殺蟲劑或工業酵素等。
- - - - 質體(plasmid)
        
        複製原(ori)
        
        能在細菌中大量複製
        
        耐抗生素基因
        
        利選殖出帶此質體的細菌株
        
        選殖位置(multiple cloning sites,MCS)
        
        供選殖基因接入的位置
      - 限制酶(restriction enzyme)
        
        認識特別的DNA序列
        
        將質體DNA切開
        
        便選殖的片段接入
      - 接合酶(ligase)及其他特別的酵素
        
        將兩段DNA接合
        
        將已切開的質體與選殖片段接成新質體
      - 勝任細胞(competent cell)
        
        經過特殊處理
        
        可接受外來質體進入
        
        原文
        
        這種細胞對於接受外來質體的能力足以勝任
    - - 1.將欲選殖基因以適當的限制酶切割出DNA片段,接入亦經限制酶切割過的載體中
        
        需考慮兩者切口是否吻合
        
        3.篩選出帶正確質體的菌落
        
        2.將接好的質體送入細菌中
        
        讓細菌轉型成具抗生素的抗藥性
        
        即可自帶抗生素的培養基中成長菌落
- - - - 用來裝載選殖基因的這個質體泛稱為載體(vector)，除了複製原起點及抗藥性基因這類必要條件外，向生技公司買來的載體通常還會有一段特別設計的序列，在短短的序列中密集分佈有很多種常用限制酶認識的序列，便於選殖利用，稱作polylinker site，有時標記成PCS (poly cloning-site)或MCS (multiple cloning site)，都是相同的東西，這些序列並不是必備的，是人為改造成方便接入選殖基因用途的。
    - - 細菌複製圓形的質體時，都會由固定的起點開始，而複製原(replicon)的定義即為具有DNA複製起點（origin，簡稱ori）及相關調控元素的單位，因此，細菌每次複製質體都需要由複製原起點開始進行。
        
        目前約發現有30種以上的複製原，複製原的種類會決定質體在細菌中存在的數量多寡
        
        在實驗室所使用的質體都是經過改造的，早期被用作工具的質體多為低複製力的(low copy number)，在一個細菌中只能複製出10個左右的質體，經過不斷改良，現在用的質體多為高複製力的(high copy number)，在一個細菌體內，可能可以複製到500個以上，很容易就可以利用細菌繁殖出大量的質體，十分方便於量產。
        
        複製原也決定各質體能否同時存在於同一個細菌中，相同複製原的質體屬於同一個不親和群體(incompatibility group)，當細菌中已經先有了某種質體，複製原和它相同的質體就不能再進入。
        
        複製原來源不同的質體，可以同時存在同一個細菌中。
    - - 根據後續實驗的需要目的，會將選殖的基因接入各式各樣的載體中，如表5-3。
        
        表5-3
      - 此外，除了典型的質體之外，有時候要載接的DNA片段太大，細菌很難接受這樣大的質體，十分不易成功轉型，即使選殖成功，純化起來也不容易。
      - 於是就有其他類似的載體工具產生，最早使用的是噬菌體λ，將DNA接入噬菌體的病毒DNA中，但受限於噬菌體外鞘包裝有限，扣除病毒DNA之後，無法攜帶太多DNA，
        後來的cosmid是在質體上放有噬菌體λ用來穿透細菌所需要的基因，因此它不需要如質體DNA般利用物理方式轉型細菌，而是以噬菌體感染細菌的方式進入細菌中，再成為圓形質體，並可以在細菌體內繁殖。
      - 隨著不斷改良，有更多能裝載大段DNA的載體被研發出來，例如利用噬菌體P1載體，利用染色體為架構的BAC (bacterial artificial chromosome)、YAC (yeast artificial chromosome)等，這類載體主要是為了裝載較大的DNA片段，用來構築基因庫之用。
      - 表5-4即為常用的基因庫載體及其特性。
        
        表5-4
      - 至於基因庫的製作請參考DNA技術的章節，有些公司或研究機構提供付費的篩選YAC、PAC及P1基因庫，將篩選到的基因株(clone)寄給需要的實驗室。
    - - 這些原本就存在的原生質體許多都帶有抗藥性基因，還有一些則是帶有能殺死其他種細菌的抑菌素基因，這些都成為生物技術上十分有用的工具。
        
        另外有一些具有經濟價值的質體，例如鏈球菌或其他相關菌種帶有一些發酵必需的酵素基因，是製造乳酪所必需的。
        
        除了質體所攜帶的特殊基因，這些細菌的原生質體的基本架構，在經過多年的研究後逐漸被改造成為實驗室可用的質體，對整個生命科學領域而言，貢獻良多。
    - - 從不同的菌種中選殖，所產生的蛋白質可能可以分解或破壞抗生素，都是細菌自己慢慢突變演化而產生的，科學家們再加以利用。
      - 在質體選殖時，可利用抗生素來篩選帶有此質體的菌株。
      - 原本不具抗藥性的細菌得到這個質體而產生了抗藥性，這個現象稱作細菌轉型(transformation)。
        
        在具有抗生素的培養基上，這個轉型的細菌可以由一個細菌不斷生長分裂，長成一個菌落(colony)。
        
        現在在實驗室中，都把“將質體送入細菌中”得到可分析的菌落的這整個過程稱為transformation。
      - 我們在抗生素縮寫的右上角標上小寫的r，代表這個質體或細菌的抗藥性。
      - 表5-2所列為常用的抗生素及作用機轉(mechanism)，而抗藥性基因則是產生能分解這些抗生素的蛋白質。
        
        表5-2
    - - 質體是圓形的DNA，在細菌體中是獨立存在的，可自行複製，和細菌本身的染色體複製是不需要有關聯性的，這種形式的DNA稱作episomic。
        
        質體是自行複製成多數，用非染色體遺傳的方式傳遞給下一代，會在細菌分裂時將質體直接分給下一代，與染色體的遺傳特性沒有關聯。
        
        並不是所有的質體都可以平均分給下一代，也就是說，在細菌一分為二的時候，子代的兩個新細菌分到的質體數目不一定相同，甚至可能有些細菌會分配不到這種質體。
- - - - 要確定帶有質體，抗生素作了第一步的篩選，能活下來的細菌就是帶有質體的，質體上的耐抗生素基因即為篩選標記。
    - - 確定載體確實有接入一段DNA。通常有幾種方式來區別細菌所帶的質體是原來的載體，或是有接入新的DNA片段。
        
        IPTG-X-gal藍白試驗
        
        原始商用質體的MCS都設計有藍白試驗的位置，一旦有其他DNA接在此處，原本在該處的β-galactosidase就無法作出，如圖5-5。此時若在培養基上塗有該酵素的受質X-gal及誘導產生酵素的IPTG，能作出酵素的細菌就可以分解X-gal，讓菌落成為藍色，這是帶有原本載體的細菌。
        
        圖5-5
        
        反之，接入DNA的質體就無法作出分解X-gal的酵素，仍為白色的菌落。
        
        細菌電泳(protoplasting)
        
        大部分的時候，實驗室的質體都經過很多步驟的剪剪接接，不再能用第一種方法來判斷，此時，還可以取少量的菌落溶解在特殊的溶液中，除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜，可依其位置大小來判斷質體是否長大了一些。
        
        如果接入的DNA小於質體的1/10，會比較難區分。
    - - 確定接入的DNA是我們想要的，如圖5-6。
        
        圖5-6
      - 通常需要進行質體的純化，以限制酶將接入的DNA片段切出來，觀察它的大小是否相符，或是該DNA片段上是否有特定的限制酶切口來判斷。
      - 在某些情況下，質體並未如我們預期一般接入我們想要的DNA，而是接入其他的DNA片段，都可以用此法區別。
      - 有些時候，需要精確的判斷接入的DNA序列是完全正確的，一字不差。特別是接入PCR的產物或是接入經過特殊酵素處理兩端的DNA片段時，那麼就需要藉由DNA的定序來確認。
- - - - 第一種產物-分子內碰撞
        
        DNA分子長鏈的兩個端點互相碰撞，因為相同切口所以可以順利接合
      - 第二種產物-分子間碰撞
        
        不同DNA分子碰撞，原本切下來的DNA小片段又接回原本的質體
    - - 1.分子碰撞:分子內自行接合易於分子間結合
      - 2.相合的突端相接較兩個平端相接容易
      - 3.相合的突端相接時需要的接合酵素約為平端相接的十分之一
      - 4.突端接合與平端接合共存時先接突端
      - 5.考慮適當的載體與插入分子比例
    - - 可利用分子內或分子間碰撞機率的差異來增加接合成功率
      - 純化載體及插入子的DNA後，進行膠體電泳來定出兩者的量
      - 插入子分子數量應至少有載體的2-5倍，插入的分子量並非越多越好，因為插入的分子可能自行相接，不利於接入載體，反而浪費掉DNA