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第5章 - Coggle Diagram
第5章
5-2質體 10812060A、10941026A
介紹
自行複製
不一定是細菌生存必須
圓形DNA,獨立存在,稱episodic
載體
裝載選殖基因的質體
抗藥性基因(必須)
限制酶辨識之序列
供選殖
生技公司買來
複製原起點(必須)
抗藥性基因
轉型
原本不具抗藥性的細菌由於得到抗藥性質體而產生抗藥性
用抗生素篩選
複製原起點及複製力
具有DNA複製起點(origin,簡稱ori)及相關調控元素的單位
可以複製到500個以上,很容易就可以利用細菌繁殖出大量的質體,十分便於量產。
複製原來源不同的質體,可以同時存在同一個細菌中
原生質體所帶基因
特殊基因
抗藥性
發酵酵素
抑菌素基因
Other...
載體的種類
根據實驗的需要目的,會將選殖的基因接入各式各樣的載體中
隨著不斷改良,有更多能裝載大段DNA的載體被研發出來,例如利用噬菌體P1載體,利用染色體為架構的BAC (bacterial artificial chromosome)、YAC (yeast artificial chromosome)等,這類載體主要是為了裝載較大的DNA片段,用來構築基因庫之用。
5-6 質體接合原理 10941002A、10941049A
2.相合的突端相接較平端相接容易
3.相合的突端相接時需要的接合酵素約為平端相接1/10
4.突端接合與平端接合共存時,先接突端
1.分子碰撞
分子內自行接合易於分子間接合
5.考慮適當的載體與插入子的分子比例
以一個接合反應中,插入子的分子數量應該至少要有載體的2~5倍
插入子的量也不是加越多越好,因為插入子也可能自行相接,相接後不利接入載體中
DNA接合時之分子碰撞關係
少掉一小段DNA的質體
分子內碰撞
產生比例較高
接回去原來大小的質體
分子間碰撞
不同分子互相碰撞
產生比例較低
由於兩種DNA各有兩個相同的切口,相接時又有一半的機會可能是反接小片段的DNA
5-1基因選殖的基本流程10941045A
限制酶
可以認識特別的DNA序列,將質體DNA切開,以便選殖的片段接入
接合酶
負責將兩段DNA接合,將以切開的質體與選殖片段接成新的質體
質體
耐抗生素基因
以利選殖出帶有此質體的細菌株
選殖位置
供選殖基因接入的位置
複製原
才能在細菌中大量複製
勝任細胞
可以接受外來質體進入。原文的意思係指這種細胞對於接受外來質體的能力足以勝任
5-3酵素10941011A
接合酶
載體和插入體必須互相配對吻合才能接合
相同限制酶產生的切口最方便,能直接接合
選殖的基因片段要接入已切開的實體,需使用它來接合
不同限制酶產生的切口,能吻合,也能接合
切口修飾酵素
想將不能吻合的兩個酵素切口相接,需用它
限制酶
判定質體有無選殖基因
質體需有至少兩個缺口,才會有兩個片段,不然質體會呈線形化
基因選殖需要,將DNA切開
5-5基因選殖的篩選
10941022A
當得到了轉型的菌落之後,必須確認細菌確實帶有我們所需的質體,通常會有數個階段的篩選
第一階段
抗生素作了第一步的篩選,能活下來的細菌就是帶有質體的,質體上的耐抗生素基因即為篩選標記
第二階段
確定載體確實有接入一段DNA。通常有幾種方式來區別細菌所帶的質體是原來的載體,或是有接入新的DNA片段。
IPTG-X-gal藍白試驗
原始商用質體的MCS都設計有藍白試驗的位置,一旦有其他DNA接在此處,原本在該處的β-galactosidase就無法作出
此時若在培養基上塗有該酵素的受質X-gal及誘導產生酵素的IPTG,能作出酵素的細菌就可以分解X-gal,讓菌落成為藍色,反之,無法作出分解X-gal的酵素,仍為白色的菌落。
細菌電泳(protoplasting)
大部分的時候,實驗室的質體都經過很多步驟的剪接,不能用第一種方法來判斷,此時,還可以取少量的菌落溶解在特殊的溶液中,除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜,可依其位置大小來判斷質體是否長大了一些
如果接入的DNA小於質體的1/10,會比較難區分
第三階段
通常需要進行質體的純化,以限制酶將接入的DNA片段切出來,觀察它的大小是否相符,或是該DNA片段上是否有特定的限制酶切口來判斷
在某些情況下,質體並未如我們預期一般接入我們想要的DNA,而是接入其他的DNA片段,都可以用此法區別
有些時候,需要精確的判斷接入的DNA序列是完全正確的。特別是接入PCR的產物或是接入經過特殊酵素處理兩端的DNA片段時,那麼就需要藉由DNA的定序來確認。
5-4勝任細胞
10941007A
利用人為的方式讓細菌的細胞壁組織改變,增加細
胞膜的通透性,好讓質體進入,這種被處理過的細
胞稱勝任細胞,具有相當的能力吃入外來DNA質體
化學方式—CaCl2 Transformation
產生了一些開口,當DNA與其混合後,以
短時間的瞬間熱處理,DNA就會被細菌吃掉
物理方式—電穿孔
細菌經由連續的低張溶液處理,與DNA混合後,接上電極,
經由瞬間電流使細胞膜暫時通透,就可以把DNA送入細菌中
細菌品系的選擇
製作勝任細胞必需要選用正處於生長旺盛期的
健康細菌,最常被用來實驗的細菌是大腸桿菌
除了大腸桿菌外,也有其他的細菌被用於質體技術,
如Bacillus subtilis ,這是一種不具病原性的桿菌,常用
在工業用途,用以產生抗生素、殺蟲劑或工業酵素等。