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第5章 - Coggle Diagram

- - - - 抗藥性基因(必須)
      - 限制酶辨識之序列
        
        供選殖
        
        生技公司買來
      - 複製原起點(必須)
  - - - 原本不具抗藥性的細菌由於得到抗藥性質體而產生抗藥性
  - - - 可以複製到500個以上，很容易就可以利用細菌繁殖出大量的質體，十分便於量產。
      - 複製原來源不同的質體，可以同時存在同一個細菌中
  - - - 抗藥性
      - 發酵酵素
      - 抑菌素基因
      - Other...
- - - - 插入子的量也不是加越多越好，因為插入子也可能自行相接，相接後不利接入載體中
  - - - 分子內碰撞
      - 產生比例較高
    - - 分子間碰撞
        
        不同分子互相碰撞
      - 產生比例較低
        
        由於兩種DNA各有兩個相同的切口，相接時又有一半的機會可能是反接小片段的DNA
- - - - 以利選殖出帶有此質體的細菌株
    - - 供選殖基因接入的位置
    - - 才能在細菌中大量複製
- - - - 抗生素作了第一步的篩選，能活下來的細菌就是帶有質體的，質體上的耐抗生素基因即為篩選標記
    - - 確定載體確實有接入一段DNA。通常有幾種方式來區別細菌所帶的質體是原來的載體，或是有接入新的DNA片段。
        
        IPTG-X-gal藍白試驗
        
        原始商用質體的MCS都設計有藍白試驗的位置，一旦有其他DNA接在此處，原本在該處的β-galactosidase就無法作出
        
        此時若在培養基上塗有該酵素的受質X-gal及誘導產生酵素的IPTG，能作出酵素的細菌就可以分解X-gal，讓菌落成為藍色，反之，無法作出分解X-gal的酵素，仍為白色的菌落。
        
        細菌電泳(protoplasting)
        
        大部分的時候，實驗室的質體都經過很多步驟的剪接，不能用第一種方法來判斷，此時，還可以取少量的菌落溶解在特殊的溶液中，除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜，可依其位置大小來判斷質體是否長大了一些
        
        如果接入的DNA小於質體的1/10，會比較難區分
    - - 通常需要進行質體的純化，以限制酶將接入的DNA片段切出來，觀察它的大小是否相符，或是該DNA片段上是否有特定的限制酶切口來判斷
        
        在某些情況下，質體並未如我們預期一般接入我們想要的DNA，而是接入其他的DNA片段，都可以用此法區別
        
        有些時候，需要精確的判斷接入的DNA序列是完全正確的。特別是接入PCR的產物或是接入經過特殊酵素處理兩端的DNA片段時，那麼就需要藉由DNA的定序來確認。
- - - - 產生了一些開口，當DNA與其混合後，以
        短時間的瞬間熱處理，DNA就會被細菌吃掉
    - - 細菌經由連續的低張溶液處理，與DNA混合後，接上電極，
        經由瞬間電流使細胞膜暫時通透，就可以把DNA送入細菌中
    - - 製作勝任細胞必需要選用正處於生長旺盛期的
        健康細菌，最常被用來實驗的細菌是大腸桿菌
        
        除了大腸桿菌外，也有其他的細菌被用於質體技術，
        如Bacillus subtilis ，這是一種不具病原性的桿菌，常用
        在工業用途，用以產生抗生素、殺蟲劑或工業酵素等。