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Ch5基因選殖 - Coggle Diagram

- - - - 原理：細胞膜通透性增加
    - - 原理：細菌經低張溶液處理，瞬間通電使細胞膜展時通透
  - - - 遲滯期
      - 旺盛期
      - 靜止期
- - - - 第一種方式無法判斷時,取少量的菌落溶解在特殊的溶液中,除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜,可依其位置判斷質體是否長大
    - - 質體的MCS一旦與其他DNA接上,則β-galactosidase無法作出.
        培養基上塗有該酵母的受質X-gal及誘導產生酵素IPTG,能作出可以分解X-gal的酵素細菌,使菌落成為藍色,若無法作出,會能為白色
  - - - 如何判斷
        
        質體純化,限制酶將接入的DNA切出來,觀察大小是否相等
        
        判斷在DNA片段是否有特定的限制酶切口
      - 使用時機
        
        在質體未如我們預期接入想要的DNA,接入其他片段時, 或需要精確判斷接入的序列時
        
        接入PCR的產物或接入經特殊酵素處理兩端的DNA片段
      - DNA接合說明
        
        選殖DNA片段以限制酶切出,質體也切開,DNA片段接入質體。
        
        質體易自行接合
        
        成功率較低
        
        必須利用限制酶切割來判斷接入方向
        
        選殖片段以限制酶A及B切割,質體也以限制酶A及B切開,再將AB接入質體中
        
        成功率較高
        
        AB片段具有方向性,只有一種方法接入質體
- - - - 提供新質體大部分架構的質體稱載體
      - 選質片段稱插入體
  - - - 5’突端是利用Klenow的方式補齊
      - 3’的突端，利用T4 DNA聚合酶將另一股DNA3’端切至與5’端平齊
  - - - 兩個切口質體才能被分成兩個片段
      - 一個切口時，質體從原形變線形，稱現形化
- - - - 一個質體以一種限制酶切去一小段DNA，再行接合，在完全切開而不個別純化的狀況下，可能會有兩類產物
        
        少掉一小段DNA的質體:DNA分子發生"分子內"碰撞，也就是DNA分子長鏈的兩個端點互相碰撞，因為是相同的切口，因此可以順利接合
        
        接回去原來大小的質體:屬於"分子間"的碰撞，也就是不同的分子互相碰撞，原本切下來的DNA小片段又接回原本的質體，這種機率較低，同時，由於兩種DNA各有兩個相同的切口，相接時又有一半的機會可能是反接小片段的DNA
      - 如果載體的兩端是相同的切口，很容易自行接合(分子內碰撞)，同時，小片段的分子也會反接入載體中，而不利其他DNA的接入(分子間碰撞)
    - - 在一個接合反應中，分別純化出載體及插入子的DNA後，應當進行膠體電泳來定岀二者的量。
        
        在設計一個反應時，應該先瞭解載體及插入子的個別分子大小，假設載體分子為4kb，而插入子為400bp，那麼兩者的分子比例為10:1，也就是說同樣重量的DNA，載體的分子數量只有插入子的1/10
        
        以一個接合反應中，插入子的分子數量應該至少要有載體的2~5倍。而插入子的量也不是加越多越好，因為插入子也可能自行相接，相接後不利接入載體中，反而浪費DNA，即使能接入，也是複數個插入子，並沒有優點
        
        載體與插入DNA之間的數量關係應維持低載體數與高插入子數，才易成功
    - - 當有突端即平端需接合時，根據原則，在載體與插入的DNA間的碰撞關係下，應先接容易的突端，形成一個分子之後，在利用分子內碰撞關係，接合平端，成功機率較高
    - - 在接合時，可以利用分子內或分子間碰撞機率的差異來增加接合成功的機率。例如兩個切口分別為平端和突端的載體要接入一小段切口相合的DNA，此時可以考慮先以小體積反應方式增加分子間的碰撞機會，並提供低濃度的酵素先接合突端，此時，接合過突端的DNA只需再行分子內接合即可，因此可以加大反應體積增加分子内碰撞機會，再加強酵素濃度，平端自然可以順利接合
- - - - 目前約發現有30種以上的複製原，複製原的種類會決定質體在細菌中存在的數量多寡
      - 在實驗室所使用的質體都是經過改造的，早期被用作工具的質體多為低複製力的(low copy number)，在一個細菌中只能複製出10個左右的質體，經過不斷改良，現在用的質體多為高複製力的(high copy number)，在一個細菌體內，可能可以複製到500個以上，很容易就可以利用細菌繁殖出大量的質體，十分方便於量產。
      - 當然，並不是說低複製力的質體就該被實驗室淘汰，它還是有利用價值的，例如，在某些時候，選殖的基因在細菌體內大量表現時，會對細菌產生毒性，造成細菌生長不良或甚至死亡，這時就需要使用低複製力的質體來降低可能的不良影響。
      - 細菌複製圓形的質體時，都會由固定的起點開始，而複製原(replicon)的定義即為具有DNA複製起點（origin，簡稱ori）及相關調控元素的單位，因此，細菌每次複製質體都需要由複製原起點開始進行。
      - 複製原也決定各質體能否同時存在於同一個細菌中，相同複製原的質體屬於同一個不親和群體(incompatibility group)，當細菌中已經先有了某種質體，複製原和它相同的質體就不能再進入。
    - - 細菌大部分的遺傳物質都存在於染色體上，也有些會存在於染色體以外的DNA也就是質體(plasmid)上
      - 質體是圓形的DNA，在細菌體中是獨立存在的，可自行複製，和細菌本身的染色體複製是不需要有關聯性的，這種形式的DNA稱作episomic
      - 質體是自行複製成多數，用非染色體遺傳的方式傳遞給下一代，會在細菌分裂時將質體直接分給下一代，與染色體的遺傳特性沒有關聯
      - 但是，並不是所有的質體都可以平均分給下一代，也就是說，在細菌一分為二的時候，子代的兩個新細菌分到的質體數目不一定相同，甚至可能有些細菌會分配不到這種質體。
    - - 另外有一些具有經濟價值的質體，例如鏈球菌或其他相關菌種帶有一些發酵必需的酵素基因，是製造乳酪所必需的。
        
        除了質體所攜帶的特殊基因，這些細菌的原生質體的基本架構，在經過多年的研究後逐漸被改造成為實驗室可用的質體，對整個生命科學領域而言，貢獻良多
        
        這些原本就存在的原生質體許多都帶有抗藥性基因，還有一些則是帶有能殺死其他種細菌的抑菌素基因，這些都成為生物技術上十分有用的工具
    - - 我們可以在抗生素縮寫的右上角標上小寫的r，代表這個質體或細菌的抗藥性。
      - 在具有抗生素的培養基上，這個轉型的細菌可以由一個細菌不斷生長分裂，長成一個菌落(colony)。
      - 原本不具抗藥性的細菌因為得到了這個質體而產生了抗藥性，這個現象稱作細菌轉型(transformation)。
      - 在質體選殖時，可以利用抗生素來篩選帶有此質體的菌株。
      - 這些基因大多是從不同的菌種中所選殖出來的，它們所產生的蛋白質可能可以分解或破壞抗生素，都是細菌自己慢慢突變演化而產生的，科學家們再加以利用
      - 現在在實驗室中，都把“將質體送入細菌中”得到可分析的菌落的這整個過程稱為transformation。
    - - 通常用來裝載選殖基因的這個質體泛稱為載體(vector)，除了複製原起點及抗藥性基因這類必要條件外，向生技公司買來的載體通常還會有一段特別設計的序列，在短短的序列中密集分佈有很多種常用限制酶認識的序列，便於選殖利用，稱作polylinker site，如圖5-1，有時標記成PCS (poly cloning-site)或MCS (multiple cloning site)，指的都是相同的東西，這些序列並不是質體本身所必備的，是人為改造成方便接入選殖基因用途的。
    - - 當然，在選殖基因時也可利用載體將之與其他特別的標記相接，作出來的基因產物即帶有標記，如蛋白質章節的介紹。
      - 此外，除了典型的質體之外，有時候要載接的DNA片段太大，細菌很難接受這樣大的質體，十分不易成功轉型，即使選殖成功，純化起來也不容易。
      - 於是就有其他類似的載體工具產生，最早使用的是噬菌體λ，將DNA接入噬菌體的病毒DNA中，但受限於噬菌體外鞘包裝有限，扣除病毒DNA之後，無法攜帶太多DNA
      - 後來的cosmid是在質體上放有噬菌體λ用來穿透細菌所需要的基因，因此它不需要如質體DNA般利用物理方式轉型細菌，而是以噬菌體感染細菌的方式進入細菌中，再成為圓形質體，並可以在細菌體內繁殖。
      - 隨著不斷改良，有更多能裝載大段DNA的載體被研發出來，例如利用噬菌體P1載體，利用染色體為架構的BAC (bacterial artificial chromosome)、YAC (yeast artificial chromosome)等，這類載體主要是為了裝載較大的DNA片段，用來構築基因庫之用。
      - 至於基因庫的製作請參考DNA技術的章節，有些公司或研究機構提供付費的篩選YAC、PAC及P1基因庫，將篩選到的基因株(clone)寄給需要的實驗室。