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UD.3 Técnicas basadas en reacciones Ag-Ac primarias - Coggle Diagram
UD.3 Técnicas basadas en reacciones Ag-Ac primarias
Enzimoinmunoensayos
Utilizan enzimas como marcadores
Inmunoensayos enzimáticos multiplicados (WMIT)
Cuando el Ag marcado forma un inmunocomplejo, la enzima se inactiva
Cuando el Ag marcado no se combina, la enzima se mantiene activa y reacciona con su sustrato produciendo color.
Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
Caracteristicas generales
El soporte
Las enzimas
Impedimento esterico
Relación de conjugación
El sustratos cromogénicos
Operaciones básicas de las técnicas ELISA
El tapizado
El bloqueo
La conjugación
Las incubaciones y lavados
No competitivos
ELISA directo para la detección de Ag (Fig. 3.5.)
ELISA indirecto para la detección de Ac (Fig. 3.6.)
ELISA sándwich DAS para detección de Ag (Fig. 3.7.)
ELISA sándwich HADAS para detección de Ag (Fig. 3.8.)
Competitivos
ELISA de competición para detección de Ac (Fig. 3.10.)
Fluoroinmunoensayos
Utilizan como marcadores sustancias capaces de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante
Técnicas de inmunofluorescencia (Fig. 3.13.)
Indirecta (IFI). El Ac o suero problema se aplica sobre el Ag, se lava y luego se añade un anti-Ac fluoresceinado contra las inmunoglobulinas del primero
Directa (IFD). Se añade la solución de Ac fluoresceinado sobre el Ag
Fluoroenzimoinmunoensayos
Radioinmunoensayos
inmunocomplejos que utilizan isótopos radiactivos como marcadores
Tipos de radioinmunoensayos
RIA en fase liquida (Fig. 3.17.)
Titulación del antisuero
Ensayo de desplazamiento
El Ag marcado y valorado
El antisuero previamente titulado
La muestra problema que contiene el Ag que se va a determinar
RIA en fase solida (Fig. 3.18.)
Con el fin de facilitar la separación de los trazados libre y unidos
Fijación del Ag
Bloqueo
Adición de la muestra problema en que se requiere determinar los Ac
Adición de anti-Ac radiomarcado, y lavado para eliminar los anti-Ac no unidos
Recuento
Inmunoensayos quioluminiscentes
Utilizan sustratos quimioluminiscentes que emiten luz cuando se da la reacción enzimática.
Técnica mas sensible que las reacciones colorimétricas
Los marcadores mas habituales
Éster de acridinio
Luminol
Lucigenina
Inmunoensayos magnético quimiolusminiscente (CMIA)
Inmunocromatografias
Cromatografía de flujo lateral, prueba de un solo paso o test rápido es un tipo de inmunoensayo en que se usan como marcadores nanopartículas coloreadas
Inmunocromatográfica para detección de Ag
Inmunocromatográfica para detección de Ac
Técnica Western Blot
Es una técnica usada para identificar una
proteína en una muestra. Normalmente se realiza con membranas de nitrocelulosa que fijan de forma no covalente proteínas y ácidos nucleicos
DOT-ELISA o método de las manchas (Fig. 3.22.)
sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por el anticuerpo.
Procedimiento
Depositar Ag y dejar secar
Bloquear la membrana con una proteína
Sumergir la muestra problema. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana
Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con una enzima
Sumergir la membrana en una solución del sustrato apropiado, capaz de dar un producto final
Recuperar la membrana y realizar la lectura
Inmunotransferencia o Western Blot
Separación de las proteínas
SDS
PAGE
Transferencia de las proteínas
Reconocimiento de las proteínas
Peroxidasa de rábano
Fosfatasa alcalina