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METHODES D'ÉTUDE DES VARIATIONS DU GENOME - Coggle Diagram
METHODES D'ÉTUDE DES VARIATIONS DU GENOME
OUTILS DE BASE
HYBRIDATION
C'est la capacité des Acides Nucléiques simple brin à s'apparier/hybrider pour
former une molécule double brin
complémentarité de bases
GC et AT/AU
Permet l'
obtention d'infos
sur une sequence cible (presence, taille) à partir de la détection par une
molécule complémentaire (sonde = radioactive/fluorescente)
à la sequence
La
dénaturation
=
stress cellulaire
(chaleur, pH, solvants organiques) =
réversible
Notion de Tm
= temperature de fusion = augmentation de la D.O quand on passe à la forme simple (exposition des bases vers l'extérieur augmente l'absorbance)
Notion de stringence
= milieu à haute température ou à concentration de sel faible qui va favoriser le
mesappariement
= formation de homoduplexes / heteroduplexes
ENZYMES DE RESTRICTION
= ENDONUCLEASES
Fragmentent l'ADN
de forme
spécifique et reproductible
Site de Restriction
= 4 à 6 nt ;
palindromique
(cad identique sur les 2 brins) ;
sensible ou non à la méthylation ("protegé") ;
isoschizomères
= 2 enzymes qui reconnaissent le même site dont une le coupera quand méthyle et l'autre l'inverse
LA TAILLE DU SITE SERA PROPORTIONNELLE À LA TAILLE DES FRAGMENTS
SITES :
GGCC
= coupure entre G et C
GGATCC
= coupure entre les 2 G
CTGCAG
= coupure entre G et A
D'où l'importance que les deux sites soient identiques
MÉTHODES D'ÉTUDES GLOBALES / NON CIBLÉÉS
SOUTHERN BLOT
Analyse
qualitative
et
semi-quantitative
des séquences d'ADN génomique =
mise en évidence des grand remaniements
(presence/absence, modifications de taille)
ÉTAPES:
1
- Isolement ADN
2
- Digestion enzymatique
3
- Séparation des fragments (par taille)
4
- Dénaturation
5
- Transfert sur support solide gel - membrane (nylon/nitrocellulose)
PRE-HYBRIDATION
6
- Hybridation (grace à la
sonde
simple brin)
7
- Révélation
NORTHERN BLOT
Analyse
qualitative et semi-quantitative
=
detection
de molécules
d'ARN
spécifiques
(pareil au SB mais sans digestion enzymatique
ÉTAPES
1
- Purification / isolement des ARNm
2
- séparation par électrophorèse (par taille) en conditions dénaturantes (suppression des liaisons H)
3
- destruction des structures secondaires qui peuvent gêner la migration (glyoxal, formaldéhyde)
4
- Précautions: RNAses (coupent l'ARN en petits morceaux)
MARQUAGE DES SONDES
=
1- NICK TRANSLATION = sur l'ADN DOUBLE brin, où la sonde va se
fixer "entre" les coupures
et l'ADN sera "recollé", ainsi la sonde est intégré via une
DNA-polymérase
(activité spécifique des sondes est plus importants car elles sont liés aux 2 brins donc on a un nb + important de sondes)
2- RANDOM PRIMING = utilisation des
"random primers"
(petites amorces aléatoires) qui vont reconnaitre leur séquence complémentaire sur l'ADN SIMPLE brin et la sonde viendra
marquer entre les amorces
, aussi incorporés par des ADN-polymerases
3- OLIGONUCLÉOTIDE DE SYNTHÈSE = Technique T4 polynucleotide kinase = greffe au nv 5' d'un nt marqué au ATP-32 qui va rendre l'oligont radioactif et permet d'identifier des mutations ponctuelles/criblage de banques
Pour ne pas utiliser la radioactivité on l'a substitué par la biotine / fluorochromes
PCR
= POLYMERASE CHAIN REACTION
Obtention d'une sequence cible
en grande quantité
grâce à un couple d'amorces qui va encadrer cette sequence (donne la
spécificité
de seq.)
Comprend
30 à 40 cycles
(réaction en chaine) en 3 étapes:
1- dénaturation à environ 95°C
2- Hybridation des amorces à 50-60°C = Tm de l'amorce
3- Extension ou Elongation par l'ADN polymérase à 72°C
À CHAQUE CYCLE LE NB DE COPIES VA DOUBLER (exponentielle)
Analyse de produits d'amplification
ELECTROPHORESE SUR GEL D'AGAROSE
1- Depôt des échantillons PCR sur le gel d'agarose (puits de dépôts)
2- Migration
3- Coloration du gel (bromure d'éthidium)
4- visualisation des produits PCR (UV)
5- Utilisation d'un marqueur de taille pour voir si correspond bien à la sequence souhaité
quand il' y a une différence de taille on peut imaginer qu'il y a eu une insertion dans le fragment PCR
SEQUENÇAGE DE L'ADN
BUT = DETERMINER
l'ordre d'enchainement
des nucleotides d'une sequence d'ADN
COMMENT=
1-à partir d'un FRAGMENT D'ADN = brin matrice pour la synthèse du brin complémentaire (cette première obtenue par PCR / clonage et de taille inferieure à 1000pb)
2- INCORPORATION aléatoire de ddNTP -ddA/ddT..- (fluorescents/radioactifs) = arrêt l'élongation du brin en cours de synthèse) = marque l'extrémité 3' (qu'eux même n'ont pas)
SEPARATION PAR TAILLE ET COULEUR (electrophorese capillaire) dans un séquenceur automatique qui restitue le chromatogramme (lecture des extrémités marquées par les ddNTPS)
on obtient une succession de pics (avec au dessus la sequence obtenue)
INTERPRETATION DES CHROMATOGRAMMES
MUTATION :
1-
hétérozygote
= 2 pics sur la même position
2-
homozygote
= un seul pic avec changement de base