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生技概論第四章蛋白質及免疫技術 - Coggle Diagram

- - - - Biotin標記
        
        以Biotin標記核酸探針或蛋白質的目的在於可以利用Avidin-Biotin之間類似抗原－抗體之間的親和性
        
        例：
        
        在免疫染色實驗中，可以將Biotin標在二級抗體上，再利用Avidin以及Biotin標記的酵素
      - DIG (Digoxigenin)標記：
        
        DIG是類固醇類的分子，可以標在核酸上
        
        合成的大分子核酸，進行各種實驗後，可用抗DIG的抗體來偵測訊號
        
        特點：靈敏度高，雜訊低
      - 磁珠標記：
        
        磁珠粉末可以標記在抗體上或核酸上
        
        目的：純化
        
        反應完成後：
        
        以磁鐵座將帶有磁珠的樣品吸附在試管底部或一側，即使不斷沖洗均不會流失。
  - - - CAT (Chloramphenicol acetyl transferase)：
        
        此酵素可將14C標記的Acetyl-CoA之甲基群轉移至Chloramphenicol上
      - β-gal (β-galactosidase)：
        
        這是最早開始作為記錄蛋白質的一種酵素
        
        利用樣本萃取物(extract)，在試管內進行酵素活性分析。
        
        同時也可將細胞或組織的樣本固定，利用受質X-gal反應的藍色產物直接呈現在樣本上
      - Luciferase（螢光酵素）：
        
        這是取自螢火蟲的螢光酵素
        
        易操作，成本低、靈敏度高，偵測快
  - - - 例：基因表現、存在位置、蛋白質交互作用及純化等
    - - 這是由八個胺基酸所組成的片段
      - 這個抗原決定位(epitope)的親水性高，在生物體中出現的頻率極低
      - 可供西方墨點實驗偵測或蛋白質純化之用。
    - - 這是取材自流行性感冒病毒(influenza virus)的蛋白質片段
      - 抗體專一性高
    - - 取材自人類致癌基因c-myc
      - 在不具有此致癌基因的生物中可以使用。
    - - 這是由六個連續的Histidine所組成的片段
      - 目的：純化蛋白質
- - - - 偵測抗體
        
        應用
        
        臨床
        
        檢測病人血液中某種特定抗體的濃度
        
        實驗室
        
        分析所製作的抗體是否達到某一強度標準
        
        原理步驟
        
        1.將抗原固定在96孔的培養盤中
        
        3.進行免疫反應
        
        4.產生有顏色或螢光的水溶液反應物
        
        2.將欲偵測的血清樣本進行連續稀釋
        
        5.藉由儀器來判讀結果
      - 偵測抗原(三明治ELISA)
        
        原理步驟
        
        2.加入欲偵測的樣本
        
        3.再依序加入另一種辨認相同抗原的一級抗體、二級抗體
        
        1.將特定的一級抗體固定在96孔的培養盤中
        
        4.判讀方法同上
        
        應用
        
        臨床
        
        檢測病人血液中某種特定抗原的濃度
  - - - 螢光
      - 化學
    - - 細胞
        
        原理
        
        以細胞株進行免疫標定，區分抗原在細胞內分佈的位置
      - 整體(whole mount staining)
        
        以整個胚體、器官等進行反應，可以瞭解抗原蛋白質在整個生物中的分佈狀況
      - 切片
        
        原理
        
        暴露出抗原所在的位置，同時也讓組織構造清晰顯露
        
        用途
        
        標定某抗原在樣本中所分佈的組織或細胞
        
        舉例
        
        冷凍切片、石蠟切片
    - - 1.樣本固定(fixation)
        
        目的
        
        保持抗原在生物樣本中的原本狀況
        
        方式
        
        冷凍切片是以急速冷凍的方式，在冷凍狀態下切片後脫水並固定
        
        石蠟切片則是先固定，脫水後再以石蠟置換(包埋)再切片
        
        整體染色則是需要以甲醛(formaldehyde)先行固定
      - 2.抗體反應
        
        採用螢光標記可以同時標定多個抗體，但一級抗體的來源必須有所區隔
        
        附圖
      - 3.結果偵測
        
        酵素標定之二級抗體
        
        直接以顯微鏡觀察
        
        螢光標定
        
        以螢光顯微鏡觀察
  - - - 利用抗體將細胞或組織萃取物中的特定蛋白質抓下來
      - 純化該蛋白質藉以分析其特性
      - 配合西方墨點實驗
        
        偵測抓下來的沉澱物中是否有其他有興趣的蛋白質，用作分析證明這些蛋白質是否與特定蛋白質在一起
- - - - 利用二級抗體上的標記酵素進行受質反應
        
        呈色反應
        
        化學冷光反應
- - - - 以蛋白質分子量大小不同為依據分離不同性質的蛋白質
    - - 利用大量帶負電的SDS，將大小、結構及帶電不同的各種蛋白質包裹起來覆蓋原本的電荷，均勻帶負電荷，成為變性狀態，也就是破壞他們的二、三級結構
  - - - 分離蛋白質分子量大小相同但不同性質的蛋白質
    - - 先依蛋白質的等電點的差異，在等電聚焦柱狀膠體中依不同pH分離，再於90度橫向以SDS-PAGE進行第二個方向的電泳，將蛋白質一一分開
- - - - 例如
        
        醣化(glycosylation)
        
        磷酸化(phosphorylation)之有無
        
        與脂質結合(lipoprotein)
    - - 例如
        
        穿插細胞膜的區塊(transmembrane domain)
        
        DNA結合的鋅手指(Zn finger)
    - - 一般認為蛋白質有四級結構
        
        一級結構
        
        即是蛋白質的胺基酸排列順序
        
        二級結構
        
        可畫出蛋白質中的特殊區域
        
        如遇到Proline之處會轉折，以及兩類蛋白質的基本結構
        
        三級結構
        
        即蛋白質的立體構造
        
        是二級結構及一些功能性區塊(domain)的組合，再加上兩個不同位置的Cysteine相遇所形成的雙硫鍵(disulfide bond)
        
        可以實際顯示出各個胺基酸的相對位置及關係，甚至可以推判出與其他蛋白質相互作用之處
        
        四級結構
        
        例如:血紅素含鐵攜氧。
        
        有些蛋白質是由多條胜肽構成，或需要與其他金屬或分子結合才能有功能
      - 隨著功能的不同，蛋白質在生物體中可能扮演
        
        調節功能的角色
        
        例如:酵素
        
        結構性的角色
        
        例如:肌肉纖維
    - - 吸光值的主要來源是胺基酸中的Tryptophan，再加上Tyrosine的少量吸光能力，在波長256 nm處也有Phenylalanine的吸光
      - 蛋白質中只要含有這些胺基酸，就會有相當的吸光量，可作為定量的依據
      - 蛋白質主要的吸光值是在280 nm
      - 蛋白質要測OD280 nm需符合相當的條件
        
        純度必須要達到某一標準
        
        通常我們要測濃度的蛋白質，大多數是在粗製的純化狀況，無法使用這種方法
    - - 每三個核苷酸代表一個胺基酸，由胺基酸所組成的長鏈稱為胜肽
      - 胜肽指的是短的多分子胺基酸，蛋白質則是很長的胜肽
      - 基因密碼解讀出的產物就是蛋白質
      - 有些蛋白質則是由幾條胜肽所組成的
    - - 較普遍的是利用Braidford原理測蛋白質濃度
        
        再測OD595 nm
        
        再將其與標準濃度的蛋白質相比，即可推算出濃度
        
        先以蛋白質染劑與樣本進行反應，其反應物呈藍色