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第4章 - Coggle Diagram

- - - - 各種蛋白質包裹起來
        
        覆蓋原本的電荷
        
        均勻帶負電荷
        
        變性(denature)
        
        破壞二,三級結構
        
        小的包裹較少SDS
        
        大的包裹較多SDS
  - - - 蛋白質依分子量大小分開
        
        小分子跑得快
        
        大分子跑得慢
  - - - 依不同pH分離
  - - - Mass Spectrum
        
        純化的蛋白質切段
        
        水解胺基酸
        
        分析序列
        
        送入蛋白質資料庫比對
- - - - 類固醇分子，標在核酸上，合成大分子核酸
    - - 可標記在核酸和抗體上，用在純化
  - - - 可將碳14標記的Acetyl-CoA甲基群移至Chloramphenico
        
        藉由產物的多寡來分析啟動子強弱
    - - 試管內進行酵素活性分析
        
        利用樣本萃取物(extract)
      - 將細胞或組織的樣本固定
        
        利用受質X-gal反應的藍色產物直接呈現在樣本上，以觀察結果，更可利用抗β-gal的抗體進行免疫染色。
    - - 螢火蟲的螢光酵素，成本低，螢光產物有效反應濃度範圍達萬倍
  - - - 細胞培養加入，標記在新合成蛋白質
      - 進行試管內轉譯時標記
      - 標在蛋白質受質
  - - - 取自流行性感冒病毒，專一性高，大多生物體不會出現類似蛋白質
        
        其他取自病毒的tag尚有SV40的T抗原及T7噬菌體的T7 tag
    - - 取自人類癌症基因c-myc
        
        在不具有此致癌基因的生物中可以使用
    - - 八個胺基酸組成，親水性高，生物體出現頻率低，抗體專一性極高
        
        可供西方墨點實驗偵測或蛋白質純化之用
- - - - 蛋白質的胺基酸排列順序
    - - 可畫出蛋白質中的特殊區域
        
        遇到Proline之處會轉折
        
        兩類蛋白質的基本構造
    - - 蛋白質立體構造
        
        是二級結構及一些功能性區塊的組合+兩個不同位置的Cysteine的相遇形成雙硫鍵
    - - 有些蛋白質是由多條胜肽組成或需與其他金屬.分子結合才有功能
        
        如血紅素含鐵攜氧
  - - - 醣化(glycosylation)
      - 磷酸化(phosphorylation)
      - 脂質結合(lipoprotein)
    - - 調節功能如酵素
      - 結構性如肌肉纖維...
- - - - 樣本以化學呈色
    - - 樣本以螢光標定
    - - 細胞
        
        以細胞株進行免疫標定，可以區分抗原在細胞內分佈的位置，是位於核中或是細胞質，甚至其他的胞器(organelle)
      - 整體類
        
        在許多生物中採用的整體染色(whole mount staining)則是以整個胚體、器官等進行反應，可以瞭解抗原蛋白質在整個生物中的分佈狀況。
      - 切片
        
        這是將組織切片以暴露出抗原所在的位置，同時也讓組織構造清晰顯露，可以用來標定某抗原在樣本中所分佈的組織或細胞。
    - - 抗體反應
        
        如同西方墨點實驗，一級抗體及二級抗體的反應程序是固定的。
      - 結果偵測
        
        如果是酵素標定的二級抗體，可以如前面西方墨點實驗的呈色反應一樣偵測反應物的呈色結果，並直接以顯微鏡觀察，如果是以螢光標定，則以螢光顯微鏡觀察結果。
      - 樣本固定
        
        目的是要保持抗原在生物樣本中的原本狀況，不因製作過程而破壞或改變，因此一定要有固定(fixation)這個步驟。
- - - - 以血清或乳蛋白，防止抗體沾佈
    - - 加入抗體，與抗原反應
    - - 蛋白質轉漬到硝化纖維膜
    - - 以一級抗體的固定區為抗原所製出抗體
      - 有特殊酵素標記
        
        鹼性磷酸酶
        
        過氧化酶
    - - 分離蛋白質
    - - 受質反應
        
        呈色反應
        
        化學冷光反應
- - - - 成本太高
- - - - 需要螢光酵素對受職進行反映而是出螢光，只能作為偵測酵素反應強度方面的應用，作為reporter
    - - 螢光是自發性的，蛋白質經過特定光波的激發後，本身就會發出螢光，可直接用來看蛋白質的各種狀態及分布，也就是綠螢光蛋白質，簡稱GFP
        
        GFP鈽彈奈實驗是用來將蛋白質變性的尿素、介面活性劑及酵素分解，高低溫變性，同時在免疫染色的甲醛固定之後仍保有自發螢光之特性