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生技概論 第五章 基因選殖 - Coggle Diagram
生技概論 第五章 基因選殖
5-6 質體接合原理(10941053A)
相合的突端相接時需要的接合酵素約為平端相接的1/10。
突端接合與平端接合共存時，先接突端。
相合的突端相接較平端相接容易。
考慮適當的載體與插入子的分子比例。
分子碰撞
分子內自行接合易於分子間接合。
第一種的產物是DNA分子發生“分子內”碰撞，也就是DNA分子長鏈的兩個端點互相碰撞
第二類的產物則是屬於“分子間”的碰撞，也就是不同的分子互相碰撞
除此之外，在接合時，我們也可以利用分子內或分子間碰撞機率的差異來增加接合成功的機率。
在我們設計一個反應時，應該先瞭解載體及插入子的個別分子大小
同樣重量的DNA，載體的分子數量只有插入子的1/10。
以一個接合反應中，插入子的分子數量應該至少要有載體的2~5倍
插入子的量也不是加越多越好，因為插入子也可能自行相接
相接後不利接入載體中，反而浪費DNA
基因選殖其實是一項簡單而實用的技術
5-2質體(10941004A、10941036A)
複製原起點及複製力
細菌複製圓形的質體時，都會由固定的起點開始,即複製原
複製原(replicon)
定義
為具有DNA複製起點（origin，簡稱ori）
相關調控元素的單位
目前約發現有30種以上的複製原
複製原的種類會決定質體在細菌中存在的數量多寡
早期
被用作工具的質體多為低複製力的(low copy number)
只能複製出10個左右的質體
現今
經過不斷改良，現在用的質體多為高複製力的(high copy number)
可能可以複製到500個以上
並不是說低複製力的質體就該被實驗室淘汰
例如
在某些時候，選殖的基因在細菌體內大量表現時，會對細菌產生毒性
複製原也決定各質體能否同時存在於同一個細菌中
相同複製原的質體屬於同一個不親和群體(incompatibility group)
當細菌中已經先有了某種質體，複製原和它相同的質體就不能再進入
複製原來源不同的質體，可以同時存在同一個細菌中
抗藥性基因
介紹
這些基因大多是從不同的菌種中所選殖出來的
它們所產生的蛋白質可能可以分解或破壞抗生素，都是細菌自己慢慢突變演化而產生
在質體選殖時，可以利用抗生素來篩選帶有此質體的菌株
細菌轉型(transformation)
介紹
原本不具抗藥性的細菌因為得到了這個質體而產生了抗藥性
標記
在抗生素縮寫的右上角標上小寫的r，代表這個質體或細菌的抗藥
性
菌落(colony)
介紹
具有抗生素的培養基上，這個轉型的細菌可以由一個細菌不斷生長分裂
transformation
介紹
在實驗室中，“將質體送入細菌中”得到可分析的菌落的這整個過程
抗藥性基因是產生能分解這些抗生素的蛋白質
圖示
原生質體所帶的基因
幾乎大部分的細菌都帶有質體
原本就存在的原生質體許多都帶有抗藥性基因
還有一些則是帶有能殺死其他種細菌的抑菌素基因
另外有一些具有經濟價值的質體,帶有一些發酵必需的酵素基因，是製造乳酪所必需的
例如:鏈球菌或其他相關菌種
除了質體所攜帶的特殊基因,細菌逐漸被改造成為實驗室可用的質體, 貢獻良多
載體
通常用來載選殖基因的質體稱為載體
載體必須要有複製原起點及抗藥性基因的條件；且向生技公司買來的通常會有特別設計的序列， 便於選殖利用
介紹
體在細菌體內複製和細菌本身的染色體複製是不需要有關聯性的，這種形式的DNA稱作episomic
質體是自行複製成多數，用非染色體遺傳的方式傳遞給下一代
質體是圓形的DNA，在細菌體中是獨立存在的，可自行複製
質體細菌分裂時將質體直接分給下一代，與染色體的遺傳特性沒有關聯
細菌有些遺傳物質會存在於質體(plasmid)上
並不是所有的質體都可以平均分給下一代
細菌一分為二的時候，子代的兩個新細菌分到的質體數目不一定相同
甚至可能有些細菌會分配不到這種質體
質體對細菌而言，不一定是生存所必需的，是否分配到質體並不影響新細菌的生長
但如果這個質體帶有抗藥性基因,若沒有從上一代得到這種質體就無法生存
載體的種類
選殖基因時，可利用載體與其他特別別標記相接，做出的基因物即帶有標記
除了典型的質體之外，有時候要載接的DNA片段太大，細菌很難接受這樣大的質體，十分不義成功轉型，於是就有其他類似的載體工具產生。
5-1 基因選殖的基本流程(10941050A)
質體
1.複製原
能在細菌中大量複製
2.耐抗生素基因
以利選殖出帶有此質體的細菌株
3.選殖位置
供選殖基因接入的位置
補充
質體的基本元素包括複製原、耐抗生素基因及可供選殖的限制酶位置
限制酶
認識特別的DNA序列，將質體DNA切開，以便選殖得片段接入
接合酶
接合酶負責將兩段DNA接合，將已切開的質體與選殖片段接成新的質體
勝任細胞
經過特殊處理的細菌，可以接受外來質體進入
基因選殖流程
5-4 勝任細胞(10941018A)
介紹
以人為的方式讓細菌的細胞壁組織改變，增加細胞膜的通透性，好讓質體更容易進入
因此有相當的能力吃入外來DNA質體
選殖方法
化學方式－CaCl2 Transformation
步驟
1.細菌經CaCl2連續處理
2.細菌之細胞膜通透性增加
3.將DNA與其混合後，以短時間的瞬間熱處理，DNA就會被細菌吃入
成效
大約每mg DNA可以得到10*7個菌落(已得到質體之細菌)
物理方式－電穿孔
步驟
1.經連續的低張溶液處理，並與DNA混合
2.接上電極，經瞬間電流使細胞膜暫時通透
3.把DNA送入細菌
成效
每mg DNA可讓109個細菌產生轉型
細菌品系的選擇
製作勝任細胞必需要選用正處於生長旺盛期的健康細菌
常用細菌
大腸桿菌(各有不同品系)
例如:防止細菌發生基因重組或突變
Bacillius subtilis(枯草桿菌，不具病原性)
常用在工業用途，產生抗生素、殺蟲劑或工業酵素
圖示
5-3酵素(10941031A)
限制酶
使用時機
1.在基因選殖時需要用到限制酶將DNA切開
2.在分析質體的時候，也會利用這個工具來
判定質體是否帶有選殖的基因片段
1.當限制酶在質體上只有一個切口時，切開的質體會從圓形變成線形，該步驟稱為線形化。
2.至少要有兩個限制酶切口，質體才能被分成兩個片段
接合酶
使用時機
當選殖的基因片段要接入已切開的質體時，須要有接合酶來進行接合的動作
二者的限制酶切口必須能互補配對吻合才能接合，通常由相同的限制酶所產生的切口最方便，直接就可以接合，但即使來自不同限制酶所產生的切口，只要互相吻合，也是可以接合的
切口修飾酵素
使用時機
若想將不能直接吻合的兩個酵素切口相接，需要將切口整修成平端的方式來解決
使用方式
5-5 基因選質的篩選(10941028A、10941044A)
介紹
當得到了轉型的菌落之後，必需確認這些細菌確實帶有我們想要的質體，通常會有數個階段的篩選。
步驟
第二階段
目的
確定載體確實有接入一段DNA。
方法
通常有幾種方式來區別細菌所帶的質體是原來的載體，或是有接入新的DNA片段
IPTG-X-gal藍白試驗
原理
原始商用質體的MCS都設計有藍白試驗的位置，一旦有其他DNA接在此處，原本在該處的β-galactosidase就無法作出
此時若在培養基上塗有該酵素的受質X-gal及誘導產生酵素的IPTG，能作出酵素的細菌就可以分解X-gal，讓菌落成為藍色，這是帶有原本載體的細菌
反之，接入DNA的質體就無法作出分解X-gal的酵素，仍為白色的菌落
細菌電泳(protoplasting)
大部分的時候，實驗室的質體都經過很多步驟的剪剪接接，不再能用第一種方法來判斷
方法
此時，還可以取少量的菌落溶解在特殊的溶液中，除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜，可依其位置大小來判斷質體是否長大了一些。
如果接入的DNA小於質體的1/10，會比較難區分
第三階段
方法
通常需要進行質體的純化，以限制酶將接入的DNA片段切出來，觀察它的大小是否相符，或是該DNA片段上是否有特定的限制酶切口來判斷
使用時機
在某些情況下，質體並未如我們預期一般接入我們想要的DNA，而是接入其他的DNA片段，都可以用此法區別
目的
確定接入的DNA是我們想要的
進階
如需要精確的判斷接入的DNA序列是完全正確的，一字不差。特別是接入PCR的產物或是接入經過特殊酵素處理兩端的DNA片段時，那麼就需要藉由DNA的定序來確認
圖片
第一階段
方法
抗生素作第一步的篩選
結果
能活下來的細菌就是帶有質體的，質體上的耐抗生素基因即為篩選標記。
目的
要確定帶有質體
