Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Иммунологические/серологические реакции - Coggle Diagram

- - - - На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена, капля сыворотки без микробов – контроль антитела, капля сыворотки с микробами – опыт.
        
        Учет реакции производят по появлению хлопьев агглютината в опыте. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.
    - - Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности.Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают титр сыворотки.
        
        Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)
        
        При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Титр, при котором говорят о наличии заболевания, называют ДИАГНОСТИЧЕСКИМ ТИТРОМ. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках. Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.
        
        При серотипировании(сероидентификации) титр должен быть не более чем в два раза меньше диагностического титра (стандарт)
  - - - О-диагностикум - получают убийством микробных клеток высокой температурой
      - Н-диагностикум - получают убийством микробных клеток формалином
    - - ПОЛУЧЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК: Животным (чаще кроликам) 5 – 7 раз через промежутки времени парентерально вводят в возрастающих дозах микробные диагностикумы (проводят гипериммунизацию), а затем у них отбирают сыворотку крови, в которой содержатся антитела к тем микробам, из которых приготовлен диагностикум.
        
        Если иммунизацию проводят О-диагностикумом, то получают О-агглютинирующие сыворотки (содержат О-антитела), если Н-диагностикумом – Н-агглютинирующие сыворотки.
      - Виды агглютинирующих сывороток
        
        Неадсорбированные сыворотки содержат групповые антитела к нескольким близкородственным видам микробов.
        
        Адсорбированные сыворотки - содержат антитела к одному или нескольким антигенам одного вида микроба.
        
        К одному антигену - моновалентные или монорецепторные
        
        К нескольким антигенам - групповые адсорбированные сыворотки
      - Титр агглютинирующей сыворотки – наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается реакция агглютинации с антигеном (титр зависит от количества антител в крови: чем больше антител, тем выше титр сыворотки).
- - - - АТ или АГ сорбированы на твердом носителе,т.е. реакцию проводят в лунках полистироловых планшетов. После добавления очередного компонента лунки промывают.
        
        При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.
        
        При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
    - - Искомые, исследуемые Ат/Аг конкурируют с мечеными Ат/Аг за связывание Аг/Ат, сорбированных на твердой фазе. Отличается учетом реакции: интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству связавшихся компонентов.
- - - - Используется для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Реакцию проводят в пробирках
      - Положительный результат - образование хлопьев преципитата (флоккулята); отрицательный результат - прозрачная жидкость
        Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками.
    - - Реакция радиальной иммунодиффузии
        
        Иммунную сыворотку смешивают с расплавленным агаровым гелем и равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок
        
        Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
        
        .Учет:чем больше диаметр кольца преципитации, тем выше концентрация антигена.
      - Реакция двойной встречной иммунодиффузии (по Оухтерлони)
        
        Растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В них раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.
        
        Учет: возможны три варианта расположения линий преципитата. К примеру, в 1 лунке известные Аг, во 2 исследуемые Аг пациента, в 3 известные Ат. В первом варианте формируется слияние линий преципитата 1-3 и 2-3 лунок (равномерная дуга). Это указывает на идентичность выявляемых Аг 1 и 2 лунок (именно и только тех Аг, против которых взяты Ат. В целом состав Аг в лунках может отличаться, но для реакции это не важно). Второй вариант: образуется "шпора", одна из линий накладывается на другую. В этом случае выявляемые Аг 1 и 2 лунок частично идентичны. В лунке с более длинной линией преципитации Аг, связанных с Ат, больше. Например, Ат взяты против 1,2,3 Аг, в первой лунке есть 1,2, во второй 1,2,3. Линия преципитации второй лунки перекроет первую. Третий вариант: линии преципитации пересекают друг друга, значит, Аг в лунках не идентичны. Например, Ат взяты против 1,2,3 Аг, в первой лунке 1,2 Аг, во второй 3 Аг. Увидим пересечение линий.
      - Иммуноэлектрофорез
        
        В пластине агарозного геля вырезают лунки и расположенные между ними канавки. В лунки вносят растворы антигенов и накладывают на гель с противоположных сторон фитили, соединяющие ее с электродным буфером в двух резервуарах. После включения тока антигены начинают мигрировать из лунок вдоль геля и разделяются. По окончании электрофореза в канавки, параллельные направлению миграции антигенов, вносят антисыворотки. Антигены и антисыворотки диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия образуются дуги преципитации. Идентичность антигенов можно определить, используя известные антигены и антитела.
        
        Учет: как для реакции двойной встречной иммунодиффузии
- - - - Непрямой реакцией называют реакцию, в которой метку присоединяют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам — антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам человека.
        
        Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твёрдофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ- АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).
    - - Прямыми называют анализы, в которых метку присоединяют непосредственно либо к заданному антигену, либо к антителу, специфичному против искомого антигена
        
        . Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.
    - - Метод, основанный на конкуренции антигенов (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антителами или антител (определяемого и меченного) за присоединение с адсорбированными на сорбенте антигенами.
        
        Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ (или АТ). Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ (или АТ). Чем больше содержание исследуемого АГ (или АТ), тем меньше меченного АГ (или АТ) связывается с АТ-м (АГ-м) на поверхности сорбента. Концентрацию меченного АГ (или АТ) определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ (АТ) в исследуемой пробе.