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Metodología, 4.1 SECUENCIACIÓN DE ARN
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Metodología
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Los ingredientes clave de una reacción de PCR son la polimerasa Taq , los cebadores, el ADN molde y los nucleótidos (componentes básicos del ADN). Los ingredientes se ensamblan en un tubo, junto con los cofactores que necesita la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten sintetizar el ADN.
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es una variación de la PCR estándar que implica la amplificación de ARNm específico obtenido de muestras pequeñas. En RT-PCR, se utilizan transcriptasa inversa y una muestra de ARN además de los reactivos de PCR estándar. La mezcla de reacción se calienta a 37 ° C, lo que permite la producción de ADNc a partir de la muestra de ARN mediante transcripción inversa. Este ADNc se hibrida con uno de los cebadores que conducen a la síntesis de la primera hebra. Continúa la PCR estándar y se produce el dsDNA. Los primers utilizados deben coincidir con el proyecto. Si se requiere la amplificación de todo el ARNm de una célula, los cebadores oligo (dT) son suficientes porque se aparean con las colas poli (A). Si se va a amplificar un ARNm específico, se puede usar un cebador específico de la región codificante.
- Comparación de lo obtenido PRE- y POS inducción con metabolitos
5.1 Mediante analisis de lo obtenido en la técnica de electroforesisis se identificará los cambios en la concentración de ARNm en el cultivo pos-exposición, el metabolito inductor y la concentración de este.
5.2 Comparando las concentraciones de ARNm se observará los efectos inductores de ciertos metabolitos en el cultivo de celulas madre de pulpa dental
- Exposición de células madres a distintas concentraciones de los metabolitos aislados previamente:
ALTA-MEDIA-BAJA de metabolitos de Plantas o de Hongos
FALTA: DETERMINAR CONCENTRACIONES
El primer paso de la técnica implica convertir la población de ARN que se va a secuenciar en fragmentos de ADNc (una biblioteca de ADNc).
Luego, se agregan adaptadores a cada extremo de los fragmentos. Estos adaptadores contienen elementos funcionales que permiten la secuenciación; por ejemplo, el elemento de amplificación y el sitio de secuenciación principal.
La secuenciación a menudo sigue métodos de secuenciación de lectura única o de pares.
Los resultados serán millones de hebras secuenciadas, estas se pueden alinear con un genoma de referencia y ensamblar para producir un mapa de secuencia de ARN que abarca el transcriptoma