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Técnica de Western Blotting - Vírus da Herpes - Coggle Diagram
Técnica de Western Blotting - Vírus da Herpes
2º Passo:
Fracionamento de proteínas
Eletroforese em gel de Poliacrilamida
(SDS-PAGE).
SDS detergente/tampão:
peso molecular x corrente elétrica.
Coloração
Comissie-Blue
ou Nitrato de Prata.
3º Passo:
Transferência das proteínas para uma membrana
Técnica conhecida como
"sandwich".
2 papeis filtros umedecidos com tampão; gel de poliacrilamida; membrana; 2 papeis filtros umedecidos com tampão. :star:
Forma um
"borrão"
no gel.
Utiliza o corante
Pouceus S
confirmando se houve a transferência.
4º Passo:
Detecção da proteína específica
Anticorpo específico reagindo com o
epítopo
.
Primeiro anticorpo:
soro do paciente.
Segundo anticorpo:
anti-IgG (com o anticorpo do
Herpes Simplex Vírus 1
).
O anticorpo primário faz a ligação e o anticorpo secundário permite a visualização, porém, ainda sem fluorescência. :star:
Conjugação:
peroxidase ou fosfatase alcalina.
Fluorófoto + laser =
luminescência.
1º Passo:
Extração e Quantificação das proteínas
Materiais utilizados:
Sangue ou líquor.
Ensaio de Bradford:
Elisa ou BSA: (curva de coeficiente linear; absorbância 595nm) > 0,98.
Utilizar
soroalbumina
(BSA) + tampão TBS.