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Técnicas de análises de DNA e RNA - Coggle Diagram
Técnicas de análises de DNA e RNA
Eletroforese por gel de Agarose (Horizontal)
Etapa 1: Preparo de um gel de Agarose semissólido com poços para amostra de DNA
Etapa 2: Retirada do pente e da fita adesiva depois da solidificação da Agarose e posteriormente, colocação do gel na cuba de eletroforese
Etapa 3: Aplicações das soluções de DNA nos poços de gel
Etapa 4: Ligar a fonte de alimentação dando início a eletroforese
Etapa 5: Retirada do gel da cuba, realizando sua coloração com brometo de etídio, para tirar fotografia sob luz UV, para a identificação do resultado
Southern Blotting
Técnica que permite a identificação de fragmentos de DNA com sequências já conhecidas ou auxiliar o posicionamento relativo destes fragmentos dentro de um seguimento DNA maior.
Subdivididos em 6 processos:
Fragmentação: Submissão de fragmentos de DNA a enzimas de restrição.
Transferência do DNA para uma membrana: Membrana composta de nylon ou nitrocelulose recebe os fragmentos de DNA, advindos da solução, posteriormente o DNA é desidratado pelo calor ou luz UV.
Marcação de Sonda: Hibridiza com a molécula de DNA, para encontrar alguma sequência específica desejada, colocando em estringência necessárias que podem apresentar diferentes resultados:
Estrigências severas: anelamento de sequência bem específico
Estringência menos severa: Variações no pareamento
Lavagem e Detecção: Retirada do excesso de sonda, removendo toda sonda não hibridizada.
Hibridização: Importante para verificar genes expressos assim como genes não expressos em uma determinada amostra.
Eletroforese: DNA é levado ao gel, onde os diferentes fragmentos serão separados por meio da polaridade e posterior visualização.
Processo utilizado para descobrir o genótipo de indivíduos em testes de paternidade, identificação criminal.
Três Técnicas Distintas de acordo com o fragmento analisado(mesmo procedimento para ambas):
Southern Blot: Fragmentos de DNA
Northern Blot: Fragmentos de RNA
Western Blot: Fragmentos de proteína
Eletroforese por gel de Poliacrilamida (PAGE) (Vertical)
Utiliza das mesmas etapas da Eletroforese por gel de Agarose, porém as moléculas de DNA utilizada nesse gel são menores do que as utilizadas na Agarose
PCR - Reação de Polimerase em Cadeira
Diferentes aplicações da PCR:
Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros)
Seleção de clones recombinantes
Sequenciamento direto de produtos amplificados
Detecção de mutações em genes específicos
Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitas
Diagnóstico pré-natal em caso de risco
Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico
Grande valia na Medicina Forense (impressão digital de DNA)
Marcadores moleculares:
Inventada em 1983 por Kary Mullis. É uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisa médicas e biológicas.
Utilizada para amplificar uma única ou poucas cópias de um pedaço de DNA e baseia-se no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo.
A reação explora a função da enzima chamada de
taq-
polimerases
, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que é uma enzima termoestável.
Necessita também de iniciadores
(Primers)
, para dar partida ao processo de síntese em um local específico.
Etapas do processo:
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Reagentes necessários para a reação:
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PCR em Tempo Real
São muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais.
Levam de 2 a 3 horas para emitir o resultado.
o resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese, graçasa adição de sondas fluorescentes às reações de PCR.
Não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente.
Seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA “
in vitro
”.
Detecta as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos.
Por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original.
PROCESSO DE PCR
Convencional
Em Tempo Real
PCR com transcrição reversa em tempo real
RT-qPCR é um dos métodos de mensurar expressão gênica mais difundidos e confiáveis utilizados atualmente...
A enzima transcriptase reversa sintetiza o DNAc correspondente de cada fita de RNA.
Inicia-se a qPCR, que recebe esse nome por dar resultados quantitativos (“q” de qPCR), diferentemente dos qualitativos da PCR convencional
Etapa é caracterizada pela amplificação de um sítio específico no conjunto de DNAc
Ocorre resumidamente, por meio do uso de:
Conforme as cadeias duplas do DNAc-alvo vão sendo sintetizadas, o fluoróforo se liga a elas
Através de análise gráfica pode-se quantificar a amostra inicial de DNAc que, na ausência de erros, é proporcional a de RNAm
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Após ser excitado, emite luz proporcionalmente ao número de cadeias duplas
Uma DNA polimerase DNA-dependente termoestável (Taq polimerase),
Dois oligômeros específicos para servirem de iniciadores para a polimerase (primers)
Um fluoróforo não específico de DNA (SYBR Green I, por exemplo).
