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Técnicas de análises de DNA e RNA, ETAPA 1: preparação de um gel de…

- - - - 1- Desnaturação: a temperatura aumenta, vai a 95º C por 15 segundos, para que ocorra a separação das fitas de DNA.
        
        2- Anelamento: ocorre o resfriamento por 55º C por 30 segundos, fazendo o anelamento dos primers sequenciadores, seguindo a posição 5' e 3', fazendo a extensão.
        
        3- Extensão: ocorrerá a partir do ponto que o primer anelou. A Taq polimerase termoestável irá fazer a extensão das moléculas a partir do primer.
        
        Os ciclos se repetem, ocorrendo as etapas de desnaturação, anelamento e extensão novamente. A cada ciclo ocorrerá um crescimento exponencial das moléculas.
  - - - Os marcadores moleculares baseados em PCR, podem ser divididos em dois grupos: dominante e co-dominante.
        
        Os marcadores co-dominantes são marcadores de PCR microsatélites, devido a mostrar a presença da banda homozigota e também heterozigota.
        
        Os marcador molecular dominante, ele marca a presença ou ausência da amplificação, então ele não é capaz de diferenciar homozigotos e heterozigotos.
- - - - TRANSF. DNA P/ MEMBRANA: A transferência ocorre em uma membrana de nylon, que é posicionada em uma solução, adicionamos pesos e absorventes, a partir disso o DNA é passa para a membrana.
        
        HIBRIDAÇÃO: A folha contendo a banda correspondente ao DNA de fita simples está dentro de um saco plastico selado contendo tampão e a sonda, de DNA marcado radioativamente, específica para a sequência de Dna desejada. A folha é exposta por um longo período de tempo à sonda sobre condições favoraveis de hibridização.
        
        LAVAGEM E DETECÇÃO: A folha removida do saco e lavada rigorosamente, somente o DNA hibridizado com a sonda ficara retido no papel. Depois é autoradiografado, o DNA que está hibridizado com a sonda aparecerá como bandas na autoradiografia.
- - - - ETAPA 5: retirada do gel da cuba, coloração com brometo de etídio e fotografia sob luz UV.