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METHODE D'ETUDE DES CELLULES ET TISSUS - Coggle Diagram
METHODE D'ETUDE DES CELLULES ET TISSUS
MANIPULATIONS GÉNÉTIQUES
Testent l'effet de la présence ou de l'absence du produit d'un gène
Inhibition (KO)
Augmentation ou diminution (KI)
Ajout d'un gène
Réalisées in vitro
Cultures cellulaires primaires
Lignées cellulaires
Réalisées in vivo
KO total : élimination dans tt l'organisme
KO conditionnel : élimination à partir d'un stade de dev donné
KO tissu-spécifique : élimination du gène uniquement dans un tissu, un organe ou un groupe de cellules spécifiques
INVALIDATION DE L'EXPRESSION D'UN GENE
Par siRNA
ARN interférents, capables de se lier spécifiquement à une séquence d'ARNm et ainsi empêcher l'expression de gènes en clivant cet ARNm
Principe
Transfection
Prise en charge du siRNA par le complexe protéique RISC
Séparation des 2 brins du siRNA
Association complexe siRNA-RISC sur l'ARNm cible et clivage
Très forte diminution de l'expression du gène : vérification par WB
MANIPULATIONS GENETIQUES IN VIVO
INVALIDATION DE L'EXPRESSION D'UN GENE PAR siRNA
Différence avec siRNA in vitro
siRNA emballés dans un vecteur qui est une enveloppe virale
Principe
9 étapes à la place de 6
Avantage
Praitque
Inconvénient
Difficile de cibler un type de cellules
MODELES ANIMAUX POUR LA TRANSGENESE
Souris et Vaches
INVALIDATION TOTALE DE L'EXPRESSION D'UN GENE PAR STRATÉGIE "CRE-LOX (flox)"
Principe
Excision du gène compris entre 2 séquences "loxP" par la "cre" recombinase
Pas de transcription en ARN du gène à invalider qui sera dégradé
Souris "cre" et "loxP" sont normales : pas d'existences naturelle des souris, elles sont fabriquées
Croisement de 2 types de souris
Souris cre : souris modifiée afin d'exprimer la cre recombianse
Souris "loxP" : le gène d'intérêt suivi d'un codon stop entouré de 2 régions "lox" dans toutes ses cellules / gène rapporteur en aval du gène d’intérêt et des régions "lox "
Souris obtenue
Souris Cre-LoxP
Pour les cellules possédant une recombinase active, le gène d’intérêt est détruit : la fluorescence de la GFP permet d'observer les zones où les cellules KO
Pour les cellules sans cre recombianse active, le gène d’intérêt fonctionne : pas de transcription du gène rapporteur et pas de fluorescence verte
INVALIDATION TISSU-SPECIFIQUE DE L'EXPRESSION D'UN GENE PAR STRATÉGIE "CRE-LOX (flox)"
Croisement de 2 types de souris
Insertion du gène "cre" en aval d'un promoteur "cellule spécifique'
Souris obtenue
Pour les cellules spécifiques: élimination du gène cible par la cre recombinase
Pour toutes les autres cellules : maintien du gène cible
EXEMPLES DE SOURIS KO POUR LE RECEPTEUR A L'INSULINE (IR) DANS DIFFERENTS TISSUS
Souris albumine-cre
Souris LIRKO : KO pour le récepteur de l'insuline dans le fois
Test de tolérance au glucose et à l'insuline dans les hépatocytes : souirs intolérantes au glucose et à l'insuline = insulino-résistantes
Souris actine-cre
Souris MIRKO : KO pour le récepteur de l'insuline dans le muscle
Diminution de la capture du glucose dans le muscle, et augmentation dans le tissu adipeux : les souris stockent plus de tryglycérides et deviennent obèses
Souris insuline-cre
Souris Bêta-IRKO : KO pour le récepteur de l'insuline dans les cellules pancréatiques bêta
Souris NEX-cre
GAIN DE FONCTION : SUREXPRESSION D'UN GENE
SIGNIFICATIVITE ET BARRES D'ERREUR
MANIPULATION GENETIQUE
SYSTEME CRISPR-Cas
SYSTEME CRISPR-Cas - Cas9
APPLICATIONS EXPERIMENTALES
APPLICATIONS THERAPEUTIQUES POTENTIELLES