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Diagnóstico molecular del SARS-coronavirus, Biología molecular. Juana…
Diagnóstico molecular del SARS-coronavirus
El SARS es una enfermedad infecciosa emergente de la cual actualmente se han registrado 8,096 casos a nivel mundial, con 774 defunciones.
Se identificó por primera vez en Guangdong,
provincia de China, en noviembre de 2002.
La infección se trasmitia de persona a persona.
El virus causante del SARS se aisló por primera vez en abril de 2003 y se identificó como un virus de ARN al que se le llamó SARS-Coronavirus (SARS-CoV).
Los casos clínicos de pacientes con SARS presentaban fiebre y neumonía, signos que no permiten diferenciar esta infección fácilmente de otras neumonías atípicas
En la actualidad, las muestras biológicas utilizadas para el diagnóstico son de esputo, exudados faríngeos o suero de pacientes con signos y síntomas sugestivos de SARS.
Entre las primeras pruebas que fueron estandarizadas se encuentran la detección de anticuerpos específicos contra el SARS-CoV.
También se logró cultivar el virus; sin embargo, su utilización no es una herramienta práctica para el diagnóstico oportuno de esta.
La técnica de RT-PCR resultó ser una prueba rápida y sensible para detectar la infección producida por el SARS-CoV en estadios tempranos de la infección.
Se obtienen resultados en 24 a 48 horas y a un bajo costo.
Extracción del ARN viral.
Las muestras utilizadas fueron de ARN viral del SARS-CoV la muestra biológica debe mezclarse vigorosamente con N-acetil-L-cisteína en volúmenes iguales y 0.9% de cloruro de sodio.
El proceso de extracción de ARN de pacientes infectados con el SARS-CoV se realizó en los laboratorios Alemanes
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Amplificación del genoma viral.
Para la identificación del genoma viral del virus del SARS-CoV se realizó la síntesis de ADN complementarios
Se llevó a cabo utilizando iniciadores que amplifican una región del genoma del virus del SARS.
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Obtención de la muestra.
La OMS recomienda que para validar las muestras positivas todas deberán procesarse por duplicado.. Además de incluir en todos los análisis controles negativos para detectar contaminación cruzada entre muestras
Las muestras utilizadas fueron de ARN viral del SARS-CoV
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RT-PCR y PCR anidada.
Esta es la seguna amplificación. En la reacción de RT-PCR se utilizaron los iniciadores BNIoutS2, BNIoutAs, BNIinS, BNIinS (cuadro I), los cuales amplifican un segmento de la región ab del ORF 1 (gen pol B).
Las muestras se prepararon agregando 2 μL ARN y 5.5 μL de agua DEPC, se incubaron durante 10 minutos a 70 C y 10 minutos en hielo.
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Despues de dichoas prosedimientos se encuentras los resutados de disgnóstico.
Los fragmentos amplificados del virus se detectaron de manera reproducible como una banda de 195 pares de bases como producto de la primera amplificación
El experimento se repitió tres veces, obteniéndose los mismos resultados en todos los ensayos. El tiempo en el que se realizaron las amplificaciones con PCR y la detección de los fragmentos amplificados fue de 10 horas
Actualmente las pruebas de diagnóstico molecular son altamente sensibles y permiten la identificación de bacterias, hongos y virus con una alta sensibilidad.
utilizando las técnicas de PCR, pueden detectarse los genomas de prácticamente cualquier microorganismo del cual se conozca la secuencia de su material genético
En este trabajo se estableció el diagnóstico molecular para el virus SARS-CoV por medio de la RT-PCR anidada en nuestro laboratorio.
Biología molecular.
Juana Yicel Hernandez Cornejo
Mapa 3
