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DNA recombinante, Clonagem molecular - Coggle Diagram
DNA recombinante
Clonagem molecular
Isola-se o DNA de dois organismos (célula humana e bactéria, por exemplo).
O DNA de cada organismo é fragmentado pela mesma enzima de restrição.
Inserto - Gene isolado.
Vetor de clonagem molecular.
As extremidades livres das duas moléculas de DNA (Inserto e Vetor) são compatíveis, coesivas.
Quando colocadas em contato, as extremidades se encaixam via ligação de hidrogênio.
Adicionam-se DNA ligases.
Reestabelece as ligações fosfodiéster dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição.
DNA recombinante
O DNA recombinante é incorporado na célula hospedeira.
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Ligam fragmentos com extremidades coesivas.
Ligam fragmentos com extremidades não coesivas.
Transformação prévia das extremidades não coesivas em coesivas.
3 more items...
Plasmídeo.
São pequenas moléculas de DNA dupla fita que contêm os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico.
Propriedades
Origem de replicação.
Sequência de DNA que permite que o vetor seja replicado na célula hospedeira.
Dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição.
Local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem.
Marca de seleção.
Gene que codifique um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada
Estes elementos genéticos cromossomais variam de 5 a 400 kb.
Fagos.
Bacteriófago λ
É um parasita obrigatório da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação.
Após a infecção da E.coli o genoma do fago pode seguir o estado lítico ou o estado lisogênico.
Limitação: o fragmento a ser clonado não deve ultrapassar cerca de 15kb.
Cosmídeo
São plasmídeos que contém um fragmento de DNA do fago λ que inclui o sítio cos.
Usados para genes que apresentam dimensões da ordem de 35 a 40 kb.
O DNA do cosmídeo é injetado no interior da célula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmídeo normal, sem expressão de qualquer função do fago.
Endonucleases de restrição
Enzimas do tipo II
Clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento.
O sítio de reconhecimento é normalmente uma sequência palindrômica.
São sequências específicas de 4 a 8 pares de base na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita.
Degradam o DNA, clivam a ligação fosfodiéster.
Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas.